甘蓝型油菜黄籽核心种质的建立和相关单核苷酸多态性标记的筛选

摘要

甘蓝型油菜属于十字花科芸薹属,是我国主要的油料作物和最重要的栽培类型。在相同的背景下,甘蓝型黄籽油菜较黑籽具有种皮薄、色素低、蛋白质含量高、含油量高、木质素含量低等一系列优点,但由于自然界中不存在天然的甘蓝型黄籽材料,人工创造选育的甘蓝型黄籽材料存在遗传背景狭窄的问题。因此开展甘蓝型黄籽油菜核心种质构建工作,有利于甘蓝型黄籽油菜种质资源的高效利用,有利于加快甘蓝型黄籽油菜的育种进程。
　　 研究学者对模式植物拟南芥种皮发育的解剖结构及色素生物合成的代谢途径已进行了深入研究,这对从分子水平上解释油菜种皮颜色合成机理具有重要的指导意义。在拟南芥中,一些编码类黄酮物质生物合成的关键酶和蛋白质基因的突变致使植物体内类黄酮物质的积累量或终产物的合成发生变化,从而引起了种皮颜色不同程度的变异。在植物学分类中,油菜与拟南芥同属于十字花科,其基因组编码的序列保守性达到86%,种皮色泽变化及色素生物合成的机理相似。拟南芥中类黄酮生物合成途径相关基因的深入研究,对于甘蓝型油菜黄籽性状的形成机理具有重要的指导意义。
　　 本研究利用SSR分子标记技术对180份重庆市油菜工程技术研究中心提供的甘蓝型黄籽油菜亲本种质进行遗传多样性分析,并结合聚类分析和材料性状分析结果,构建了甘蓝型黄籽油菜的核心种质。同时,根据拟南芥中与透明种皮相关的基因的保守区域设计引物,以黄黑籽甘蓝型油菜为材料,对其进行了PCR扩增及克隆测序,期望能够找到与种皮色泽相关的单核苷酸突变位点并转化为功能标记,用于分子标记的辅助选择育种。主要结果如下:
　　 1.甘蓝型油菜黄籽材料的遗传多样性分析
　　 本研究中60对SSR引物均能在180份材料的基因组DNA中产生明显的扩增差异谱带,共检测出308个等位基因的标记位点,每对SSR引物所产生的等位基因数为1-11个,平均位点为5.1个,其中多态性位点207个,多态性比率为67.2%,平均每对引物获得3.45个多态性位点,其多态性比率为20%-100%,平均为66.75%。对SSR.扩增结果进行UPGMA分析,结果表明,180份甘蓝型油菜黄籽材料的相似系数为0.56-1.00,在阈值为0.566时,将180份材料分为3个类群,其中第三个类群仅包含1个亲本材料,其它179份材料被划分为两个类群,其聚类结果与种质来源具有一致性。
　　 2.180份甘蓝型油菜黄籽材料核心种质的构建
　　 利用SSR标记技术、聚类分析和种质材料的重要性状分析相结合的方法,筛选出遗传背景相距较远、遗传多样性较丰富及种质特性差异明显的20份材料作为核心种质资源,所得到的核心种质的比例为初始种质的11.11%。将筛选出的20份核心种质与原始种质群体采用双样本t测验进行比较,所选的核心种质的性状与原始种质群体无显著差异,初选的核心种质能够有效地代表参试群体的遗传多样性。
　　 3.与甘蓝型油菜种皮色泽相关的单核苷酸突变位点的筛选
　　 本研究以黄黑籽甘蓝型油菜为材料,对19个与透明种皮色泽相关的基因进行了PCR扩增及克隆测序,在甘蓝型黄黑籽之间共有14个基因得到了相应的拷贝序列,这些基因在甘蓝型油菜中均存在基因的多个拷贝序列和单核苷酸序列多态性位点差异,我们从BnTT3,BnTT6和BnTT18三个基因中筛选出了可能与黄黑籽性状相关并存在唯一的限制性内切酶位点的单核苷酸多态性位点。但用限制性内切酶ApalⅠ,SalⅠ,PvuⅡ,ClaⅠ对从黄黑籽的基因组中扩增产物进行了酶切检测,检测结果表明,在这些突变位点中切出的目的条带数目与我们预测的条带数存在差异,所以根据目前的结果还不能确定这些单核苷酸的突变是否是引起甘蓝型油菜种皮色泽差异的主要原因,仍需要进一步的研究来证明。