基于分子标记的桔小实蝇起源地推断、扩散路径重构及扩散模式研究

摘要

桔小实蝇Bactroceradorsalis属双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，是一种多食性的害虫，近年来在我国呈暴发为害的趋势，严重威胁果蔬生产。采用分子标记重构桔小实蝇的扩散历史对揭示桔小实蝇成功扩散的因素，制定检验及防控措施具有重要意义。然而，由于采样范围有限及分析方法相对单一等因素，基于遗传信息的桔小实蝇扩散历史的研究还有相当的局限。鉴于此，本论文开展了以下四方面的研究：1.基于线粒体cox1基因获取的遗传学信息，推断桔小实蝇的起源地及其扩散路径；2.联合线粒体nad1，nad5及cytb等3个基因，全面分析桔小实蝇在中国大陆的扩散模式；3.采用高灵敏性的微卫星分子标记研究近年入侵重庆地区的桔小实蝇的种群遗传结构，佐证桔小实蝇扩散路径的分析结果；4.分析实验室内桔小实蝇寄主转换后遗传信息的变化，为研究桔小实蝇扩散过程中寄主转换对入侵的影响打下基础。主要研究结果及结论如下：
　　 1.桔小实蝇起源地及扩散路径的推断。采用线粒体cox1基因为标记，分析包括野外采集的中国大陆地区14个桔小实蝇种群、巴基斯坦拉合尔的1个种群，及从Genbank中获取中国台湾地区的1个种群、中国大陆的10个种群、美国夏威夷的1个种群和印度的1个种群等亚太地区35个桔小实蝇种群的分子变异、单倍型组成、遗传多样性、遗传分化、种群遗传结构、单倍型及种群系统发育关系、种群间的个体迁移及群口历史等。
　　 序列变异分析表明，桔小实蝇cox1序列的变异程度很高，505bp的基因片段上有125个多态性位点，其中83个为简约信息位点，cox1序列的碱基组成有明显的A+T偏向性。在亚太地区的35个桔小实蝇种群中共发现217个cox1的单倍型，其中47个为共享单倍型。台湾地区的8个单倍型中有5个被18个种群共享；中国东南沿海地区与东南亚地区的种群都与台湾地区有共享单倍型，但两者间几乎无共享单倍型存在；中国内陆的种群与中国东南沿海及东南亚地区的种群均存在共享单倍型；美国火奴鲁鲁种群与亚洲地区的种群没有共享单倍型存在，巴基斯坦拉合尔种群仅与中国四川攀枝花的种群有共享单倍型。上述两种群的遗传多样性也较低，而亚太地区其余33个种群表现出极高的遗传多样性，且近年来才建立的种群的遗传多样性高于较早建立的种群。巴基斯坦拉合尔及美国火奴鲁鲁等2个分布边缘区的种群与其余33个种群间的遗传分化程度很高，而亚洲地区的33个种群遗传分化不显著。将35个桔小实蝇种群按地理分布及前人研究结果划分为7个组群，通过遗传分化分析发现，从台湾地区向西，遗传分化程度随地理距离的增加而加大。7个组群的群口历史分析表明，台湾地区的桔小实蝇经历过明显的种群扩张过程，且该种群的扩散时间最长，从台湾地区向西，随着地理距离的增加种群的扩散时间也变短。种群邻接系统发育树显示，中国东南沿海及东南亚地区的种群分属发育树的两支，而中国内陆的种群在这两支均有分布。空间分子变异分析(SAMOVA)将35个桔小实蝇种群划分为美国夏威夷组群及亚洲组群，说明太平洋阻碍了桔小实蝇在亚洲及夏威夷群岛间的扩散，分子变异分析(AMOVA)表明有29.28％的变异发生在组群间。单倍型网络图也清晰的显示出美国夏威夷组群的单倍型除H208外都聚在一起。同时，不对称迁移率的分析表明美国夏威夷及亚洲地区桔小实蝇种群间的基因交流十分有限。
　　 根据以上研究结果及历史记录，我们认为：1.台湾地区有可能是桔小实蝇的起源地。2.从台湾岛起源后，桔小实蝇在亚洲大陆沿两条路径传播。一条为台湾岛到中国东南沿海，另一条为台湾岛到东南亚地区，中国内陆是这两条传播路径的交汇区。3.巴基斯坦地区的桔小实蝇来源不明。4.美国夏威夷群岛的桔小实蝇可能来自于二战后的人为携带，且该地区的种群由于太平洋的阻隔及检疫措施的实施与亚洲的桔小实蝇呈现出明显的遗传分化。根据亚太地区桔小实蝇种群遗传现状，提出了有针对性的防控措施。
　　 2.桔小实蝇在中国的扩散模式。联合采用nad1，nad5及cytb等3个线粒体基因片段对几乎覆盖中国大陆桔小实蝇分布区的12个种群的遗传多样性、遗传结构、种群间不对称迁移率及群口历史等进行分析。序列变异分析表明，桔小实蝇nad1，nad5及cytb序列都具有较高的变异程度，多态性位点的个数分别为101，129及186个。12个桔小实蝇种群分别在nad1，nad5及cytb上发现132，142及143个单倍型。各种群的单倍型组成分析显示，福州、广州等发生历史记录较早的种群中共享单倍型的比例较高，而发生历史记录较晚的种群的单倍型组成大部分为稀有单倍型。无论是分别以3个线粒体基因单独计算12个种群的遗传多样性还是以3个基因的联合序列计算，中国大陆的12个桔小实蝇种群的遗传多样性都很高，且重庆地区及武汉等近年来才建立的种群的遗传多样性高于福州、广州等种群。种群间遗传分化的分析表明，虽然地理距离相隔较远，但中国内陆的种群与东南沿海的种群间没有产生遗传分化。Mantel检验也表明，种群间的遗传分化不是由地理隔离造成的。空间分子变异分析(SAMOVA)将12个种群分为东南沿海、海南岛及内陆等3个组群，但是这3个组群间的遗传分化并不显著，仅有不到10％的分子变异是发生在组群间。采用传统的单倍型系统发育及单倍型网络图也发现，分属于不同组群的单倍型在发育树上的分布方式与划分的组群不符。种群间不对称迁移率的检测发现，个体在大部分两两种群间的迁移都是对称的，但发现广州种群向福州种群、向海南岛的文昌种群及向内陆的武汉、秀山、江津和万州等种群有较强的迁出迁移率存在。显著或极显著的负Tajiama’sD和Fu’sFs值及明显呈单峰型的错配分布表明中国大陆的桔小实蝇经历过明显的种群扩张，且发生扩张的主要区域为中国内陆。扩张前后种群数量比值显示，桔小实蝇在扩张的过程中种群数量增长巨大。
　　 根据以上结果，我们认为：1.桔小实蝇在中国大陆经历了明显的种群扩张并伴随着快速的种群增长，这一过程主要发生在中国内陆。2.由于不同来源地桔小实蝇的多重入侵，使桔小实蝇在扩散的过程中未经历瓶颈效应。3.中国东南沿海地区是桔小实蝇向中国内陆扩散的桥头堡。
　　 3.新近入侵重庆地区的桔小实蝇的遗传结构。采用8个高度多态性的微卫星分子标记对覆盖渝西至渝东的6个桔小实蝇种群的遗传结构进行研究。重庆地区的桔小实蝇在8个微卫星位点上共检测到51个等位基因，其中在MS4位点上最多，在3.2B位点上最少。Shannon’s信息指数Nei’s基因多样性指数表明，重庆地区的桔小实蝇遗传多样性丰富，采用I.A.M及T.P.M模型均未发现这6个种群近期经历过瓶颈效应。6个种群的表观杂合度Ho均较低，导致这6个种群在大部分位点上偏离哈迪-温伯格平衡。固定指数分析表明，重庆地区的6个桔小实蝇种群种群内近交系数及总近交系数均较高，但种群间遗传分化程度很小，仅7.77％的变异发生在种群间。6个种群间平均为2.9961的基因流及最大仅为0.2367的遗传距离也反映了这几个种群间的遗传分化程度很低。聚类分析软件Structure将6个种群分为两支，其中武隆种群的个体组成与其余5个种群不同。种群邻接发育树也显示，武隆种群单独为一支，而其余5个种群聚为一支。
　　 以上结果表明：1.桔小实蝇可能沿着两条路径迁入重庆地区。2.不同来源地桔小实蝇的多重入侵造成重庆地区种群的遗传多样性高，且多重入侵克服了种群建立阶段的瓶颈效应。3.种群建立初期由于个体数量有限而导致种群内近交较为严重，表现为杂合度不足、偏离哈迪-温伯格平衡。
　　 4.寄主转换对桔小实蝇遗传分化的影响。将长期在香蕉上继代饲养的桔小实蝇部分转移到脐橙上，分别以香蕉及脐橙继代饲养以获得实验种群。筛选出4对在桔小实蝇室内种群上能表现出多态性的微卫星引物。分别以香蕉和脐橙饲养5代，10代及15代的6个室内种群的遗传多样性都很低，且脐橙种群随着饲养代数的增加遗传多样性降低。哈迪-温伯格平衡随着饲养世代数的增加逐渐由不平衡变为平衡。6个种群间的基因交流非常有限，平均仅为0.8707。在隔离饲养的最初几代，桔小实蝇两种寄主种群间的遗传距离较小，随着饲养代数的增加遗传距离也增大，同种寄主上下代间的遗传距离大于同世代不同寄主种群间的遗传距离。采用不同分组方法进行的分子变异(AMOVA)也表明，同种寄主不同世代的种群间的遗传变异更大。
　　 造成上述结果的主要原因为：1.隔离饲养及选择压力造成实验室种群遗传多样性低及桔小实蝇不同寄主水果种群间的遗传分化。2.遗传漂变的作用大于选择压力而使同种寄主不同世代种群间的遗传分化更大。3.继代饲养过程中的种群数量增加及对寄主的适应使种群逐渐达到哈迪-温伯格平衡。