美洲商陆杀螨活性物质的追踪分离及作用方式研究

摘要

美洲商陆作为一种传统药用植物，其医用活性已经得到了广泛且深入的研究，其在农业方面的应用也有所报道;如从美洲商陆中分离的商陆抗病毒蛋白(PAPs)能抑制多种植物病毒的传染;其溶剂提取物对多种农业害虫具有较强的生物活性;对小麦纹枯病菌Rhizotoniacerealis等植物病原菌也具有一定的抑菌性能。但关于美洲商陆对朱砂叶螨生物活性的报道则相对较少。
　　 本项实验从美洲商陆的整株出发，筛选对朱砂叶螨活性最强的生长部位进行研究，明确其对朱砂叶螨不同螨态的作用方式，并对活性最佳部位进行分离提取及活性化合物的分离鉴定;同时，研究最佳活性化合物对朱砂叶螨的不同作用方式，为后续开发美洲商陆的农用价值奠定基础。
　　 1、美洲商陆各部位对朱砂叶螨的活性筛选
　　 对美洲商陆的整株，包括根、茎、叶分别用石油醚、丙酮和甲醇三种极性的溶剂浸泡，提取浓缩后得9种浸膏，并测定这9种浸膏在浓度为2.5mg/ml时对朱砂叶螨雌成螨的触杀活性。通过活性对比，筛选出美洲商陆根丙酮提取物的杀螨活性最好，处理48h后的校正死亡率为95.66％，LC50为2.1637mg/mL，与其他提取物相比差异显著。
　　 2、美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨作用方式的研究
　　 在明确了美洲商陆根丙酮提取物的活性最佳后，以其作为研究对象，研究其对朱砂叶螨的不同作用方式，包括触杀、驱避、内吸和产卵抑制作用。以1.20、2.16和3.91mg/mL作为实验浓度。浓度为2.16mg/mL时，处理48h后，美洲商陆根丙酮提取物对幼螨和若螨的校正死亡率分别为69.85％和68.42％，处理72h的活性分别为89.04％和80.81％。同时，美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨各螨态也表现出较高的驱避活性，在处理72h后，对幼螨和若螨的驱避率均保持在96％以上;对雌成螨的驱避活性，则随着处理时间的推移而逐渐下降，在处理12h时的活性最高，各浓度处理组均达到了Ⅲ级以上，84h后活性则下降，仅为Ⅱ级，驱避活性较弱。
　　 另外，美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨雌成螨也表现出较强的产卵抑制活性，在处理96h后，各浓度处理组对雌成螨的产卵抑制活性均高达为70％以上。然而，其对朱砂叶螨雌成螨的内吸活性则不明显;在处理72h后，只有3.91mg/mL的处理组内吸活性达到了72.87％，其他两个处理组的内吸活性均不足51％，未表现出明显的内吸效应。
　　 3、活性化合物的追踪分离及结构鉴定
　　 采用常压柱层析法，对商陆根丙酮提取物进行柱层析分离和薄层层析(TLC)检测，得15个组分。将这15个组分配制成浓度为2mg/mL的药液，测定其对朱砂叶螨雌成螨的触杀活性，以第9组分的杀螨活性最强，处理12h和24h的校正死亡率分别为60.84％和95.75％，提取率却仅为2.2％。为了提高目标化合物的提取率和节约提取时间，对柱层析原料美洲商陆根丙酮提取物进行了乙酸乙酯和正丁醇超声波萃取，将各萃取液和残渣进行了杀螨活性对比，结果表明正丁醇萃取液的活性最好，对朱砂叶螨雌成螨48h后的触杀活性高达97.43％。经柱层析分离和活性化合物追踪，明确组分11的活性最佳，48h后的LC50为0.9323mg/mL，提取率则高达15.02％，与之前柱层析所得有效成分的提取率仅为2.2％相比，提高了近13％。
　　 对美洲商陆根有效成分进行提取浓缩过滤后，得白色无定形粉末，经甲醇重结晶后，得白色无定形晶体，命名为:抗螨结晶物(简称:AMC)。通过定性检测（皂色反应），显示AMC中主要含有三萜皂苷类及糖类化合物;经LC/MS、IR色谱鉴定，通过与文献数据对比，初步明确其中含有的皂苷类化合物主要为商陆皂苷P(MW=680)，其他成分有待进一步鉴定。
　　 4、抗螨结晶物(AMC)不同作用方式的研究
　　 测定了抗螨结晶物(AMC)对朱砂叶螨的不同作用方式，包括触杀、驱避、内吸、杀卵及产卵抑制活性。最主要的作用方式是触杀活性，并有一定的驱避和产卵抑制作用，有微弱的内吸和杀卵活性。测定触杀活性时，只有最高浓度1mg/mL的处理组对朱砂叶螨幼螨和若螨表现出较好的活性，处理72h后的校正死亡率分别达到了73.74％和88.39％，其他低浓度处理组的活性均不明显，处理72h的死亡率也还不足40％。AMC对朱砂叶螨雌成螨的驱避活性则随着处理时间的延长而逐渐降低;各浓度处理组在处理12h后的驱避率均达到Ⅲ和Ⅳ级，之后便随处理时间的延长而减弱。AMC对朱砂叶螨雌雌成螨的产卵抑制活性表现出先升后降的变化趋势，浓度为0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的处理组在48h的产卵抑制率最高，72h有所下降，96h又有所升高;而4mg/mL处理组的产卵抑制活性则随着处理时间的延长而增加，在处理72h后，其产卵抑制率都高达86.89％，但浓度为0.25mg/mL的处理组则未表现出明显的产卵抑制活性。
　　 另外，AMC对朱砂叶螨表现出较弱的内吸活性和杀卵活性，只有浓度为2mg/mL和4.0mg/mL的处理组分别表现出一定的内吸活性和杀卵活性，其他低浓度处理组均未表现出明显的内吸与杀卵活性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 植物次生代谢物质对朱砂叶螨的活性研究

1．1 植物次生代谢物质的杀螨活性

1．2 植物源杀螨剂主要活性成分

1．3 植物源杀螨剂遇到的问题及展望

2 中药商陆的生物活性研究概况

2．1 中药商陆植物学特征及鉴别

2．2 中药商陆在医药方面的应用

2．3 中药商陆在农业方面的应用

2．4 中药商陆化学成分的研究

3 论文立题依据和研究思路

3．1 立题依据与目的意义

3．2 研究的主要内容和技术路线

第二章 美洲商陆不同部位杀螨活性研究

1 美洲商陆不同部位提取物的获得

1．1 供试材料

1．2 试验方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

2 美洲商陆各部位不同溶剂提取物杀螨活性的比较

2．1 供试材料

2．2 试验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第三章 美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨作用方式研究

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 试验方法

1．3 统计分析

2 结果与分析

2．1 美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨幼螨和若螨的触杀活性

2．2 美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨幼螨、若螨和雌成螨的驱避活性

2．3 美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨雌成螨的产卵抑制活性

2．4 美洲商陆根丙酮提取物对朱砂叶螨雌成螨的内吸活性

3 讨论

第四章 美洲商陆根杀螨活性物质的分离鉴定

1 美洲商陆根丙酮粗提取物柱层析分离有效成分

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 结果与分析

1．4 讨论

2 柱层析有效成分分离方法的改进研究

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．3 结果与分析

3．4 讨论

3 美洲商陆根有效成分的纯化及结构鉴定

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第五章 抗螨结晶物(AMC)对朱砂叶螨作用方式的研究

1 材料与方法

1．1 供试材料

1．2 试验方法

1．3 统计分析

2 结果与分析

2．1 AMC对朱砂叶螨幼螨的触杀活性

2．2 AMC对朱砂叶螨若螨的触杀活性

2．3 AMC对朱砂叶螨雌成螨的驱避活性

2．4 AMC对朱砂叶螨雌成螨的产卵抑制活性

2．5 AMC对朱砂叶螨雌成螨的内吸活性

2．6 AMC的杀卵活性

3 讨论

3．1 有效成分AMC对朱砂叶螨幼螨和若螨的触杀活性

3．2 有效成分AMC对朱砂叶螨的驱避活性

3．3 有效成分AMC对朱砂叶螨雌成螨的产卵抑制活性

3．4 有效成分AMC对朱砂叶螨雌成螨的内吸活性

3．5 有效成分AMC对朱砂叶螨的杀卵活性

第六章 结论与展望

1 主要结论

2 展望

参考文献

附图

硕士期间发表论文目录

致谢