鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)酚类及挥发性物质代谢累积与土壤环境因子的相关性研究

摘要

中药质量控制是实现中药标准化、产业化、现代化、国际化的基础和关键，药效物质是支撑中药质量的基石，由于中药自身的复杂性，使得中药药效物质基础研究未取得突破性进展，绝大多数中药的药效物质基础尚不清楚。人们对中药药效物质调控规律的生物本质还缺乏认识。受环境因素影响，中药药效物质的代谢累积（含量）差异很大，导致中药质量很不稳定。因此，研究中药药效物质的代谢积累过程、药效物质之间的相关联系及其影响因素，已成为提高中药质量的主要基础科学问题之一。鱼腥草作为传统“药食同源”中药，具有酚类及挥发性物质协同作用表现的显著抗氧化活性以及其他多种生物活性。由于地域、气候以及栽培技术等因素影响鱼腥草酚类及挥发性物质的代谢累积（含量），导致鱼腥草的质量难以保证。探讨环境因子对鱼腥草酚类及挥发性物质的代谢累积过程的影响及其相关联系，对揭示鱼腥草药效物质基础和稳定鱼腥草质量具有重要意义。本论文工作从代谢组学角度，基于多学科交叉理论，通过现代仪器(HPLC和GC-MS)分析等手段，系统研究鱼腥草酚类及挥发性物质代谢积累过程、物质之间的相关性以及这些物质与土壤环境因子的相关性。建立酚类及挥发性物质在线分析方法，明确物质代谢积累变化趋势，探讨与土壤环境主要因子之间的相关性。另外，初步探讨了抗氧化活性与酚类物质间的相关性。结果如下:
　　 1、建立了HPLC-DAD同时测定16种酚类物质（绿原酸、东莨菪内酯、牡荆素、芦丁、阿福豆苷、异槲皮苷、芸香柚皮苷、山奈苷、槲皮苷、槲皮素、山奈素、猫眼草酚、紫花牡荆素、5-羟基-3'，4'，6，7-四甲氧基黄酮、5-羟基-3，3'，4，7-四甲氧基黄酮和莰非醇-3，7，4'-三甲醚含量）的分析方法;建立了GC-MS同时测定25种挥发性物质(α-蒎烯、樟烯、β-蒎烯、2-甲基-2-戊烯醛、月桂烯、柠檬烯、桉叶醇、反-2-己烯醛、松油烯、顺-3-己烯乙酯、1-己醇、α-环氧蒎烷、顺-3-己烯-1-醇、反-2-己烯-1-醇、癸醛、芳樟醇、乙酰龙脑、β-石竹烯、甲基正壬酮、4-松油醇、龙脑、癸醇、丁香酚、异植醇和植醇）的分析法。该两种方法均线性良好:r2＞0.9990;精密度、重复性和稳定性较好:RSD＜5％;回收率:98.53-102.25％;样品用量少(仅0.05g)，不破坏植物正常的生理活动，适于鱼腥草酚类及挥发性物质的动态监测。
　　 2、建立了35个不同地域来源的鱼腥草叶中多酚、总黄酮、16种酚类及25种挥发性物质的代谢累积（含量）以及根际土壤微生物特性、酶活性及养分状况的数据库。结果显示不同地域来源鱼腥草主要酚类及挥发性物质含量、土壤微生物PLFAs的丰度、酶活性和养分状况因来源不同而异，且它们之间存在相互作用关系。
　　 3、初步阐明了鱼腥草的生长总体上促进土壤微生物繁殖，并且影响微生物群落结构。通过不同地域来源的鱼腥草同—地点连续栽培2年后，结果显示根际土壤的细菌、G+、G-、真菌、放线菌及总PLFAs丰度总体显著高于对照;但单个土壤微生物的PLFAs丰度有些升高，如:α-15(∶)0，18(∶)1ω9t，有些降低，如:i-16(∶)0，14(∶)0。
　　 4、明确了鱼腥草酚类物质的代谢累积（含量）主要受环境因素影响，而挥发性物质的代谢累积（含量）主要受遗传因素和环境因素影响。结果显示，不同地域来源的鱼腥草（酚类和挥发性物质差异显著）在同一地点栽培后，其酚类物质含量差异不显著，而挥发性物质的成分和含量以及样品之间差异的变化趋势与不同地域来源的鱼腥草基本一致。
　　 5、明确了鱼腥草主要酚类及挥发性物质在生长过程中代谢累积（含量）的变化趋势:(1)叶和根状茎主要酚类及挥发性物质的含量随时间变化先升后降，在生殖生长期含量最高;(2)花、叶和根状茎酚类物质含量的变化趋势为:花＞叶＞根状茎;(3)花主要酚类物质的含量变化趋势为:初花期上升、盛花期最高，终花期又降低;(4)主要挥发性物质的含量因化合物种类及植株部位（花、叶和根状茎）不同而异。
　　 6、探讨鱼腥草主要酚类及挥发性物质与土壤环境因子（微生物群落结构，酶活性以及养分）之间的相关性，揭示鱼腥草可以促进土壤微生物的繁殖、酶活性及活化土壤养分，可能与酚类及挥发性物质的代谢有关。结果显示:(1)单一酚类或挥发性物质与某种或几种或某一类微生物的PLFAs生物标记丰度呈显著相关性（P＜0.05），与总细菌、总真菌、总放线菌和总微生物的PLFAs丰度的相关性因化合物而异;多酚和总黄酮与总细菌、总放线菌和总微生物的PLFAs丰度呈显著正相关（P＜0.05），与总真菌呈显著负相关（P＜0.05）;提示了鱼腥草酚类及挥发性物质累积影响土壤微生物群落结构。(2)单一酚类及挥发性物质与过氧化氢酶、磷酸酶、尿酶、多酚氧化酶和蔗糖酶中的一种或几种酶有显著相关性（P＜0.05），多酚和总黄酮与过氧化氢酶、磷酸酶和多酚氧化酶呈显著正相关（P＜0.05）。(3)多酚和总黄酮与有效钾、有效磷和有机质呈显著正相关（P＜0.05）;单一酚类及挥发性物质与有效磷、有效钾、碱解氮和有机质中的一种或几种呈显著相关性（P＜0.05），如:绿原酸与有效钾、有效磷和有机质呈显著正相关(P＜0.05);α-蒎烯和甲基正壬酮与碱解氮呈显著性正相关(P＜0.05);α-蒎烯、癸醛和β-石竹烯与有机质呈显著正相关（P＜0.05）;樟烯、甲基正壬酮、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯和乙酰龙脑与有效钾和有效磷呈显著正相关(P＜0.05）。这表明土壤环境因子诱导和影响鱼腥草酚类及挥发性物质的代谢累积。
　　 7、初步探讨了酚类物质含量与抗氧化活性的相关性。结果表明，多酚和总黄酮与提取物的DPPH·清除率呈显著正相关（P＜0.05），单个酚类物质与提取物的DPPH·清除率呈正相关，但不显著，这说明鱼腥草抗氧化能力是单个酚类物质抗氧化能力的总贡献，具有有机的整体性。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究问题的提出及意义

1．1．1 问题的提出

1．1．2 研究意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 鱼腥草生物活性的研究状况

1．2．2 鱼腥草酚类及挥发性物质的研究状况

1．2．3 鱼腥草酚类及挥发性物质影响因子的研究状况

1．3 研究目的、内容、技术路线

1．3．1 研究目的

1．3．2 研究内容

1．3．3 技术路线

第2章 16种酚类物质HPLC分析方法的建立

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验药品、试剂与仪器

2．2．2 实验材料

2．2．3 HPLC色谱条件

2．2．4 数据统计与分析

2．3 实验结果与分析

2．3．1 提取方法的优化

2．3．2 色谱条件的优化

2．3．3 标准曲线，定性检测限LOD和定量检测限LOQ

2．3．4 精密度、重复性和稳定性

2．3．5 回收率

2．3．6 验证实验

2．4 本章小结

第3章 25种挥发性物质GC-MS分析方法的建立

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 药品、化学试剂与溶剂

3．2．2 实验仪器

3．2．3 实验材料

3．2．4 样品的制备

3．2．5 GC-MS色谱条件

3．2．6 数据统计与分析

3．3 实验结果与分析

3．3．1 测定物质定量离子的选择

3．3．2 标准曲线、定性检测限LOD和定量检测限LOQ

3．3．3 精密度、重复性和稳定性

3．3．4 回收率

3．4 本章小结

第4章 不同地域来源鱼腥草土壤微生物群落结构、酶活性及养分含量

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器和试剂

4．2．2 实验材料

4．2．3 微生物PLFAs生物标记丰度分析

4．2．4 土壤酶活性测定

4．2．5 土壤养分含量测定

4．2．6 数据分析与统计

4．3 实验结果与品分析

4．3．1 土壤微生物PLFAs生物标记丰度分析

4．3．2 土壤细菌／真菌、细菌／放线菌、G+／G-分析

4．3．3 土壤酶活性分析

4．3．4 土壤养分分析

4．3．5 土壤微生物的PLFAs丰度与酶活性的相关性分析

4．3．6 土壤微生物的PLFAs丰度与养分含量的相关性分析

4．3．7 土壤酶活性之间及其与养分含量之间的相关性分析

4．4 本章小结

第5章 不同地域来源鱼腥草酚类物质代谢累积与抗氧化活性以及土壤环境因子的相关性

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验药品、试剂与仪器

5．2．2 实验材料

5．2．3 16种酚类物质测定

5．2．4 多酚测定

5．2．5 总黄酮测定

5．2．6 抗氧化活性

5．2．7 数据统计与分析

5．3 实验结果与分析

5．3．1 不同地域来源鱼腥草酚类物质分析

5．3．2 清除DPPH·活性分析

5．3．3 酚类物质与DPPH·活性的回归分析

5．3．4 酚类物质与土壤酶活性的回归分析

5．3．5 酚类物质与土壤养分的回归分析

5．3．6 酚类物质含量与土壤微生物的PLFAs丰度的相关性分析

5．3．7 聚类分析

5．3．8 主成分分析

5．4 本章小结

第6章 不同地域来源鱼腥草挥发性物质代谢累积与土壤环境因子的相关性

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验仪器与材料

6．2．2 GC-MS色谱条件

6．2．3 供试样品的制备

6．2．4 数据统计与分析

6．3 实验结果与分析

6．3．1 主要挥发性物质差异性分析

6．3．2 主要挥发性物质含量之间的相关性分析

6．3．3 主要挥发性物质与主要酚类物质含量之间的相关性分析

6．3．4 主要挥发性物质含量与土壤酶活性的相关性分析

6．3．5 主要挥发性物质含量与土壤养分的相关性分析

6．3．6 主要挥发性物质含量与土壤微生物的PLFAs丰度的相关性分析

6．3．7 聚类分析

6．3．8 主成分分析

6．4 本章小结

第7章 栽培鱼腥草酚类及挥发性物质代谢累积及其与土壤环境因子的相关性

7．1 引言

7．2 实验部分

7．2．1 实验药品与仪器

7．2．2 实验材料

7．2．3 实验方法

7．2．4 数据统计与分析

7．3 实验结果与分析

7．3．1 鱼腥草不同器官多酚和总黄酮含量分析

7．3．2 栽培鱼腥草叶主要酚类物质分析

7．3．3 栽培鱼腥草根状茎主要酚类物质分析

7．3．4 栽培鱼腥草花主要酚类物质分析

7．3．5 栽培鱼腥草叶挥发性物质分析

7．3．6 栽培鱼腥草根状茎主要挥发性物质分析

7．3．7 栽培鱼腥草花主要挥发性物质分析

7．3．8 栽培鱼腥草土壤微生物特性分析

7．3．9 栽培鱼腥草叶主要酚类物质与土壤环境因子的相关性分析

7．3．10 栽培鱼腥草根状茎主要酚类物质与土壤微环境因子的相关性分析

7．3．11 栽培鱼腥草叶主要挥发性物质与土壤环境因子的相关性分析

7．3．12 栽培鱼腥草根状茎主要挥发性物质与土壤环境因子的相关性分析

7．4 本章小结

第8章 结论、创新点与展望

8．1 主要结论

8．2 特色和创新之处

8．3 展望

参考文献

致谢