槲皮素-7-硫酸酯钠的抗氧化活性及对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化作用的研究

摘要

目的：槲皮素-7-硫酸酯钠是通过磺化反应人工半合成的水溶性槲皮素衍生物，我们的前期研究证实其体外有较强的抗氧化活性并对DNA氧化损伤有保护作用，本文进一步研究其体内外抗氧化活性及对前成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖分化的作用，为其将来药用提供理论及实验依据。
　　 方法：⑴不同浓度的槲皮素-7-硫酸酯钠(Sodium quercetin-7-mono-sulfate，SQMS)组(0.1 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L)和维生素C(Vitamin C，VC)(0.25 mmol/L)对小鼠体外肝匀浆抗氧化的检测，用试剂盒总抗氧化能力(Total antioxidantcapacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)进行相应指标的测试。⑵不同剂量的SQMS组(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)和VC组(200 mg/kg)对小鼠连续灌胃6d，取血清、肝组织匀浆和心脏匀浆进行体内抗氧化的测试，用试剂盒SOD、MDA进行相应指标的检测。⑶槲皮素-7-硫酸酯钠对小鼠前成骨细胞株MC3T3-E1增殖的作用在标准的培养条件下，将小鼠前成骨细胞株MC3T3-E1分组为空白组、槲皮素组(Quercetin, Que)(终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，不同浓度SQMS组(终浓度分别为1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L);采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测不同浓度的Que和SQMS对MC3T3-E1细胞增殖的影响。⑷在标准培养条件下，采用对硝基苯磷酸二钠法(disodium4-nitrophenylphosphate，PNPP)检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性，钙离子含量、一氧化氮(Nitric oxide，NO)含量及一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)活力、细胞中MDA和培养上清MDA含量的检测，用相应的试剂盒进行测试;并对相关基因(Runx-2，Smad4，Tnfrsf11b，GSS，SOD1和SOD2)进行实时定量PCR(Real-Time PCR, RT-PCR)检测。
　　 结果：①槲皮素-7-硫酸酯钠的体外抗氧化活性实验与空白组比较，VC组能显著的升高T-AOC;SQMS低浓度组能升高T-AOC，但结果无统计学差异，SQMS中和高浓度组能显著升高T-AOC。VC组能增加SOD活性，但结果无统计学差异，SQMS低和中剂量组能显著升高SOD活力，SQMS高剂量组能增加SOD活力，但结果无统计学差异。VC组能极显著的降低MDA产生，SQMS的三个浓度也能显著降低MDA产生。②槲皮素-7-硫酸酯钠的体内抗氧化活性实验血清中各药物组的MDA含量均无统计学差异;肝匀浆中的MDA含量在SQMS高剂量组中有下降的趋势，但结果均无统计学差异;心脏匀浆中MDA含量在SQMS中和高剂量组中也有下降的趋势，但结果均无统计学差异。SOD的测试结果表明，血清中的SOD在VC、SQMS低和中剂量组中的活力有上升的趋势，SQMS高浓度组有降低SOD活力，但结果均无统计学差异;肝匀浆中的SOD活力，除了SQMS中剂量组有升高外，其它组SOD活力均降低，结果无统计差异;心脏匀浆显示各组都有升高SOD活力，但除了SQMS高剂量组升高SOD活力有显著差异外，其它组结果均无统计学差异。③在标准的培养条件下，24 h时Que低和中浓度对MC3T3-E1有增殖的作用，但结果无统计学差异，Que高浓度组、SMQS三个浓度组能极显著促进MC3T3-E1增殖;Que三个浓度组在48 h对MC3T3-E1有增殖作用，但结果无统计学差异，SQMS三个浓度组对MC3T3-E1有显著的增殖作用;Que低浓度组在72 h能增加MC3T3-E1增殖，但结果无统计学差异，Que中和高浓度组和SQMS能极显著增加MC3T3-E1增殖。④槲皮素-7-硫酸酯钠对小鼠前成骨细胞株MC3T3-E1分化实验在标准的培养条件下，MC3T3-E1给药6d后，各组的ALP活力无明显变化;给药9d后，SQMS中和高浓度组能明显升高ALP活力;给药12d，SQMS低、中和高浓度有升高ALP活力的作用，但结果均无统计学差异，Que组无升高ALP活力。给药9d，Que组对钙离子含量有升高的作用，但结果均无统计学差异，SQMS低、中和高浓度组有极显著升高钙离子含量的作用;给药12 d，各用药组均无升高钙离子含量的作用。给药48 h和72 h后，所有药物组有明显升高NOS活力的作用;Que无明显增加NO含量，SQMS低和中浓度组有明显抑制NO含量，SQMS高浓度组对NO含量无明显作用;所有药物组对细胞中MDA含量生成都有增加作用，但结果均无统计学差异;Que对细胞培养上清中MDA含量产生有明显抑制作用，SQMS各组对细胞培养上清中MDA含量产生有抑制作用，但结果均无统计学差异;给药72 h后，Que有显著升高NOS活力作用，SQMS各组有极显著升高NOS活力作用;Que和SQMS高浓度组无明显增加NO含量，SQMS低和中浓度组有显著抑制NO产生;各组药物均有增加细胞中MDA含量，但结果均无统计学差异;Que有显著降低细胞培养上清中MDA含量，SQMS各组对细胞培养上清中MDA含量无明显作用。
　　 结论：⑴SQMS可提高体外肝组织匀浆T-AOC、增加SOD活力、降低MDA含量和提高体内心肌组织SOD活力的作用，进一步证实其具有较高抗氧化活性。⑵SQMS能显著促进MC3T3-E1细胞增殖和分化，其促增殖分化作用与其降低MDA含量，增加NOS活性，促进GSS基因的表达有关。

目录

声明

摘要

前言

1 研究背景

2 研究目的

3 研究内容

第一部分 SQMS的抗氧化活性研究

1 研究目的

2 材料与方法

2．1 实验动物

2．2 主要试剂

2．3 主要器材

2．4 实验方法

3 结果

3．1 SQMS对小鼠体外肝匀浆MDA含量的影响

3．2 SQMS对小鼠体外肝匀浆T-AOC的影响

3．3 SQMS对小鼠体外肝匀浆SOD活力的影响

3．4 SQMS对小鼠血清、肝和心匀浆MDA含量的影响

3．5 SQMS对小鼠血清、肝和心匀浆SOD活力的结果

4 讨论

第二部分 SQMS对MC3T3-E1成骨细胞增殖分化的作用研究

1 研究目的

2 材料与方法

2．1 受试对象

2．2 主要试剂

2．3 主要器材

2．4 实验方法

3 结果

3．1 SQMS对MC3T3-E1细胞增殖的影响

3．2 SQMS对碱性磷酸酶活力的影响

3．3 SQMS对MC3T3-E1细胞钙离子含量的影响

3．4 SQMS对MC3T3-E1细胞NOS活力及NO含量影响

3．5 SQMS对MC3T3-E1细胞内及培养上清MDA含量影响

3．6 SQMS对Tnfrsf11b，Smad4，Runx-2，GSS，SOD1和SOD2基因表达的影响

4 讨论

4．1 SQMS对MC3T3-E1细胞增殖的作用

4．2 SQMS对MC3T3-E1细胞分化的作用

4．3 SQMS对MC3T3-E1细胞抗氧化系统的作用

小结

参考文献

文献综述 槲皮素及其衍生物药理活性研究进展

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读硕士期间科研情况