中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因表达的影响

摘要

近几年，由细菌引起的水产动物疾病给渔业发展造成了严重的经济损失，由维氏气单胞菌引发的致病情况呈现上升趋势。随着抗生素的频繁使用，致病菌对抗生素产生了耐药性。目前，使用中药防治细菌性疾病已得到越来越多的认可，但是中药成分复杂，究竟是哪种成分能够有效抑制甚至杀死致病菌，对其作用机理的研究却不多，细菌毒力基因的作用及研究更少。因此，本试验筛选几种抑菌效果较好的中药有效成分作用维氏气单胞菌，以期从毒力基因的表达水平变化，来解释中药有效成分的作用机理，为中药有效成分应用水产动物疾病的防治提供理论基础。
　　 试验Ⅰ:维氏气单胞菌的分离鉴定
　　 从发病的乌鳢体内分离到一株优势菌，命名为swurc，经人工感染后证实其对鲫鱼有相同的病兆现象，且有较强的致病性，本试验以分子鉴定16S rRNA序列为主，结合分离株swurc的生理生化鉴定结果，确定病原菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。构建系统发育树，结果表明该菌16S rRNA序列与同源性较高的前40位的菌株均为维氏气单胞菌(A.veronii)，同源性在99％以上。
　　 试验Ⅱ:维氏气单胞菌毒力基因气溶素Aero与外膜蛋白OMP的克隆及其序列分析
　　 根据相关文献引用气单胞菌气溶素Aero与外膜蛋白OMP毒力基因引物序列，以维氏气单胞菌菌株swurc的基因组DNA为扩增模板，经PCR扩增后，分别克隆到pMD19-T载体上，构建得到重组质粒，筛选阳性克隆鉴定，送检测序，然后对扩增得到的基因片段序列进行同源性比对，结果显示PCR扩增得到气溶素Aero基因417bp，外膜蛋白OMP基因1017bp。克隆得到的Aero基因蛋白序列与相关GenBank报道的Aero基因蛋白序列同源性最高达到99％，OMP基因蛋白序列与相关GenBank报道的OMP基因蛋白序列同源性最高达到99％。本试验根据GenBank公布的气单胞菌Aero和OMP毒力基因序列在保守区域设计引物，能够扩增出本试验维氏气单胞菌菌株的毒力基因片段，表明气单胞菌属相同的毒力基因具有较高的同源性。
　　 试验Ⅲ:维氏气单胞菌的药敏试验
　　 试验选取12种中药有效成分（槲皮素、苦参碱、黄岑苷、虎杖苷、山奈酚、盐酸小檗胺、没食子酸、橙皮苷、大黄素、木犀草素、大黄素甲醚、芦丁对照品），采用平板挖洞法对维氏气单胞菌菌株swurc进行药敏试验。然后采用二倍稀释法测定各有效成分对维氏气单胞菌菌株swurc的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:没食子酸表现出高度敏感性，槲皮素、大黄素、黄芩苷和山奈酚表现出中度敏感性，其余中药有效成分表现出低度敏感性。槲皮素对维氏气单胞菌MIC最小，为0.125mg/mL，MBC为0.25 mg/mL;没食子酸和黄芩苷MIC和MBC均为0.25 mg/mL;大黄素MIC为0.25 mg/mL，MBC为0.5 mg/mL。
　　 试验Ⅳ:体外中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因表达的影响
　　 从维氏气单胞菌的药敏试验结果中选取抑菌效果较好的没食子酸、槲皮素、黄芩苷和大黄素4种中药有效成分，分别以其各自的MIC作为中间浓度，设定3个浓度梯度作用维氏气单胞菌。提取维氏气单胞菌总RNA，反转录进行毒力基因的PCR扩增，并以16S rRNA作为内参，分析中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因表达水平的影响。结果没食子酸、黄芩苷作用维氏气单胞菌其毒力基因Aero与OMP的0.25mg/mL组与0.5mg/mL组同空白组相比均表现为显著性差异(P＜0.05);槲皮素作用其毒力基因Aero与OMP的0.25mg/mL组同空白组、0.0625mg/mL组和0.125mg/mL组相比均表现为显著性差异（P＜0.05）;而大黄素作用其毒力基因Aero的0.5mg/mL组同空白组、0.125mg/mL组和0.25mg/mL组相比表现为显著性差异(P＜0.05)，其毒力基因OMP的0.25mg/mL组与0.5mg/mL组同空白组相比差异显著(P＜0.05)。表明随着中药有效成分浓度的增加，毒力基因表现出不同程度的依赖性递减表达，说明中药有效成分能够抑制维氏气单胞菌毒力基因Aero与OMP的表达。
　　 试验V:鱼体内中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因表达的影响
　　 选择没食子酸、槲皮素、黄芩苷和大黄素4种中药有效成分，分别以其MIC作为中间浓度，设定3个浓度梯度拌饵投喂鲫鱼。一周后，以维氏气单胞菌攻毒，每尾鲫鱼注射维氏气单胞菌应用菌液108cfu/mL0.2mL，一周后解剖频临死亡的鲫鱼，取病兆部位肝胰脏提取细菌总RNA，反转录后PCR扩增毒力基因Aero与OMP，结果没有扩增出毒力基因片段。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 维氏气单胞菌的国内外研究现状

1．2 气单胞菌毒力因子的研究

1．3 气单胞菌鉴定和检测方法

1．4 中药对水生动物的疾病防治

第二章 引言

第三章 维氏气单胞菌的分离鉴定

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果与分析

3．4 讨论

第四章 维氏气单胞茵毒力基因Aero与OMP的克隆及其序列分析

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果与分析

4．4 讨论

第五章 维氏气单胞菌的药敏试验

5．1 材料

5．2 方法

5．3 结果与分析

第六章 体外中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因Aero与OMP表达的影响

6．1 材料

6．2 方法

6．3 结果

6．4 讨论

第七章 鱼体内中药有效成分对维氏气单胞菌毒力基因Aero与OMP表达的影响

7．1 材料

7．2 方法

7．3 结果与分析

第八章 结论

第九章 进一步研究建议

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文及参加课题