利用酵母双杂交系统筛选家蚕BR-C转录因子的相互作用蛋白

摘要

昆虫变态发育是通过内分泌激素即蜕皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenilehormone，JH)滴度的协同变化来协同调节的。JH的作用主要在于使昆虫维持幼虫形态;在幼虫前几龄的末期在有适量JH合成的前提下，高浓度的20E能引起幼虫发生生长蜕皮;幼虫末龄后期至成虫羽化前则没有JH的合成，预蛹期和蛹发育末期出现的高滴度20E分别引起化蛹和化蛾变态蜕皮。关于20E和JH的信号传导以及两者之间协同调节的分子机制，一直以来是昆虫变态发育研究的核心问题。
　　 昆虫BR-C(Broadcomplex)蛋白是一个含BTB蛋白相互作用结构域和锌指结构域的转录因子，其功能在于介导20E和保幼激素JH信号的信号传导。以往对昆虫BR-C的研究主要集中在两个方面:一是BR-C如何响应JH和20E信号;二是BR-C如何通过锌指结构域调控靶标基因的转录。但是，到目前为止，还没有关于与BR-C互作蛋白的研究报道。鉴于此，本研究拟以家蚕为模式，利用酵母双杂交cDNA文库扫描技术来筛选鉴定BR-C的互作蛋白，以期为研究BR-C在20E和JH信号传导通路中的新的作用方式及完善20E和JH的信号传导机制奠定基础。
　　 (1)家蚕丝腺酵母双杂交cDNA文库的构建
　　 鉴于家蚕丝蛋白的合成可能受到BR-C介导的20E信号的调节，我们拟以家蚕丝腺组织为材料来构建用于筛选BR-C互作蛋白的酵母双杂交cDNA文库，首先，应用RT-PCR方法调查了BR-C基因在家蚕丝腺中的表达谱，结果显示，BR-C基因在家蚕幼虫5龄丝蛋白大量合成期到预蛹期凋亡前的丝腺组织中都有表达。我们据此选取了家蚕5龄1天、5龄3天、5龄5天、5龄7天、刚上蔟、上蔟1天以及上蔟2天等七个时间点分离获得丝腺组织，并提取总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测显示，28srRNA、18srRNA以及5srRNA条带清晰，没有明显拖带，且OD260/280值均在1.9～2.0之间，OD260/230值在2.0左右，表明RNA质量较好。进一步将不同时间点的RNA进行等量混合，用适量混合的总RNA为模板，采用SMART反转录技术合成cDNA并经长链PCR(LD-PCR)扩增;琼脂糖凝胶电泳检测显示，所合成的cDNA主要分布在100～3000bp的范围内。将cDNA与线性载体PGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞，获得家蚕丝腺组织的酵母双杂交cDNA文库。文库质量检测表明，所构建的家蚕丝腺cDNA文库的滴度为1.28×107cfu/ml，插入片段在100～2000bp之间，平均插入片段为753bp，重组率为64.8％，大于500bp的重组率为44.4％，大于500bp占重组率的百分比为68.6％。这些数据表明所构建的家蚕丝腺cDNA文库质量较高，可以用于BR-C互作蛋白的筛选。
　　 (2)家蚕BR-C蛋白BTB结构域为基础的诱饵质粒构建
　　 基于酵母双杂交cDNA文库筛选原理，通过RT-PCR扩增获得家蚕BR-C转录因子BTB结构域的编码序列，测序验证后回收目的片段，然后将其与目标载体pGBKT7（带有酵母转录调控因子DNA结合结构域编码区的表达载体）连接后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并筛选得到阳性克隆，扩大培养后提取获得含BR-C转录因子BTB结构域编码序列的融合表达诱饵质粒，命名为pGBKT7/BTB。另外，考虑到在酵母双杂交体系中，由于可能存在假阳性的可能存在，使实验结果具有一定的不确定性，其中最关键的因素就诱饵蛋白对酵母表达系统的毒性作用和自激活效应。在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA三种营养缺陷型培养基上对融合表达诱饵质粒pGBKT7/BTB进行毒性和自激活效应检测发现，重组诱饵质粒对Y2HGold酵母无毒性和自激活效应，可以用于对家蚕丝腺组织cDNA文库进行酵母双杂交筛选。
　　 (3)家蚕BR-C相互作用蛋白的酵母双杂交筛选
　　 根据Clontech公司的MatchmakerTMGoldYeastTwo-HybridSystem这一酵母双杂交技术的原理，以BR-C的蛋白相互作用结构域BTB为诱饵，对家蚕丝腺组织cDNA文库进行，筛选时以Y2HGold[pGBKT7-53]×Y187[pGADT7-T]作为阳性对照，以Y2HGold[pGBKT7-Lam]×Y187[pGADT7-T]为阴性对照。在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA营养缺陷型（二缺）培养基上筛选后，获得了64个阳性克隆，继而在SD/Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA营养缺陷型（四缺）培养基上经过反复的三轮筛选，最后总共得到了54个可能与BR-C的BTB结构域有相互作用的阳性克隆。进一步对这些阳性克隆中的cDNA片段进行PCR扩增、T克隆、测序及序列比对分析，结果显示，这54个阳性克隆中的cDNA序列与8种蛋白质的编码序列相匹配。其中，17个阳性克隆的cDNA序列与RACK1的编码序列相匹配，另外还有Ser1、Fib-H、eiF3g和RpS16等，这些可能就是家蚕丝腺中能与BR-C发生相互作用的蛋白。
　　 (4)BR-C与RACK1的相互作用分析
　　 鉴于RACK1能介导PKC（ProteinkinaseC，蛋白激酶C）的信号传导，并通过与目标蛋白相互作用而使其发生磷酸化后修饰，我们拟重点研究RACK1与家蚕BR-C的相互作用的功能。首先通过RT-PCR获得了家蚕RACK1和BR-CZ2的完整开放阅读框序列，并通过LR反应，构建了用于细胞共定位的pie2venus-RACK1和pie2venus-BR-C重组质粒。细胞共定位结果显示，在家蚕BmN4细胞中，家蚕BR-C定位于细胞核，而RACK1则主要定位于细胞质中，但在细胞核中也有少量表达。原核表达了BR-C与RACK1的活性蛋白并通过Far-westernblot验证了它们之间的相互作用。以往的研究显示，RACK1在信号分子磷酸化修饰及信号分子转位等方面发挥功能，我们推测，BR-C与RACK1之间的相互作用，可能是介导BR-C的磷酸化后修饰，但具体情况如何则还有待进一步的深入研究证实。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 家蚕及其它昆虫变态发育的激素调节

1．1．1 家蚕及其它昆虫保幼激素和蜕皮激素的滴度变化规律

1．1．2 家蚕及其它昆虫蜕皮激素的信号传导

1．1．3 家蚕及其它昆虫保幼激素的信号传导

1．2 转录因子BR-C在家蚕及其它昆虫变态发育中的功能

1．2．1 BR-C属于BTB-ZF类转录因子家族

1．2．2 BR-C参与20E和JH的信号传导

1．2．3 昆虫BR-C调节目标基因表达并参与多种生物学过程

1．2．4 家蚕BR-C基因的功能研究

1．3 酵母双杂交技术

1．3．1 酵母双杂交技术的原理

1．3．2 利用酵母双杂交技术鉴定目标蛋白的相互作用蛋白

第二章 引言

2．1 研究背景及目的意义

2．2 研究内容

2．2．1 构建家蚕丝腺组织酵母双杂交cDNA文库

2．2．2 构建家蚕BR-C蛋白BTB结构域为基础的诱饵质粒

2．2．3 家蚕BR-C相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

2．2．4 候选互作蛋白RACK1与BR-C的相互作用分析

2．3 技术路线

第三章 家蚕丝腺酵母双杂交cDNA文库的构建

3．1 实验材料与试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．2 实验方法和步骤

3．2．1 家蚕丝腺组织BR-C基因表达谱分析

3．2．2 cDNA的合成与纯化

3．2．3 cDNA转化Y187感受态细胞

3．2．4 cDNA文库质量检测

3．3 实验结果与分析

3．3．1 家蚕丝腺组织BR-C基因表达谱分析

3．3．2 家蚕丝腺总RNA的提取

3．3．3 cDNA的合成与纯化

3．3．4 cDNA文库构建及质量检测

3．4 讨论

第四章 家蚕BR-C蛋白BTB结构域为基础的诱饵质粒构建

4．1 实验材料与试剂

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．2 实验方法和步骤

4．2．1 诱饵质粒的构建

4．2．2 诱饵质粒毒性效应检测

4．2．3 诱饵质粒自激活效应检测

4．3 实验结果与分析

4．3．1 诱饵质粒的构建

4．3．2 诱饵质粒毒性效应检测

4．3．3 诱饵质粒自激活效应检测

4．4 讨论

第五章 家蚕BR-C相互作用蛋白的酵母双杂交筛选

5．1 实验材料与试剂

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂

5．2 实验方法和步骤

5．2．1 酵母双杂交对照实验

5．2．2 诱饵质粒与文库酵母双杂交筛选

5．2．3 阳性克隆的鉴定

5．2．4 候选基因生物信息学分析

5．3 实验结果与分析

5．3．1 酵母双杂交对照实验

5．3．2 诱饵质粒与文库酵母双杂交筛选

5．3．3 阳性克隆的鉴定

5．3．4 候选互作蛋白的生物信息学分析

5．3．5 候选互作蛋白编码基因的组织表达特征分析

5．4 讨论

第六章 BR-C与RACK1的相互作用分析

6．1 实验材料与试剂

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验试剂

6．2 实验方法与步骤

6．2．1 LR反应载体的构建

6．2．2 BR-C与RACK1亚细胞定位分析

6．2．3 BR-C与RACK1的相互作用验证

6．3 实验结果与分析

6．3．1 LR反应载体构建

6．3．2 BR-C与RACK1的亚细胞定位

6．3．3 BR-C与RACK1的原核表达

6．3．4 BR-C与RACK1相互作用验证

6．4 讨论

第七章 综合与结论

参考文献

附件

硕士在读期间发表的论文及参研课题

致谢