一个新的水稻白化基因AL13(t)的精细定位及其候选基因的确定

摘要

植物通过光合作用可以将太阳能转化为可利用的化学能并产生氧气和有机物。植物的光合作用主要依靠叶片完成，水稻的产量主要来自叶片的光合作用，因此水稻叶片生长的好坏将严重影响产量的高低。叶绿体是植物进行光合作用的场所，与碳同化密切相关，其形态、结构以及数目的变化都会影响光合作用。叶绿素含量的变化也会直接影响光合速率。叶绿体的发育和叶绿素的形成是受核基因和叶绿体自身基因共同控制的，某些基因的突变将导致叶绿体发育缺陷、叶绿素合成受损和光合功能受阻等，进而形成典型的叶色突变。水稻叶色突变体是研究光合系统结构和功能、叶绿素生物合成及叶绿体发育的理想材料。本试验所发现的突变体al13(t)是从粳稻中花11的组培后代中分离出来的，叶色白化，由于突变株叶绿体发育不正常，不能进行光合自养，在3叶期死亡。本研究以野生型中花11为对照，对突变体al13(t)进行了形态学鉴定、遗传分析、光合色素测定、净光合速率测定以及叶绿体的电镜观察，并通过初步定位、精细定位、候选基因预测对目的基因AL13(t)进行了定位分析。主要研究结果如下:
　　1.al13(t)突变体的表型鉴定
　　与野生型中花11相比，突变体从发芽后至3叶期一直表现白化，3叶后（一个月左右）逐渐死亡。
　　2.al13(t)突变体叶绿体的超微结构分析
　　通过电镜观察，我们发现al13(t)突变体的叶绿体发育受损，内部缺少正常类囊体片层结构，有很多嗜锇颗粒的存在。研究表明叶绿体发育过程大体分为三个阶段:前质体时期、类囊体单片层形成期和基粒形成期，根据我们的电镜观察结果al13(t)突变体的叶绿体发育停留在前质体时期。
　　3.al13(t)的光合色素及光合特性分析
　　白化突变体al13(t)几乎未检测到叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素，含量都极显著小于野生型，所以突变体中光合色素的合成存在明显障碍。
　　白化突变体al13(t)净光合速率为负值，说明由于突变体只有呼吸作用没有进行光合作用，植株不能自养而死亡。
　　4.AL13(t)基因的遗传分析
　　以缙恢1号与突变体al13(t)构建F1群体，F1植株叶片表现正常，单株收获F2代种子，根据后代叶色是否分离，选留叶色分离的种子混合形成遗传分析和基因定位的F2代群体。F2群体中出现性状分离，对428株F2代植株进行调查研究发现，正常单株(308株)∶白化突变株（120株）符合3∶1的分离比例(x2=1.93＜x20.05=3.84)，说明al13(t)性状受1对隐性核基因控制。
　　5.AL13(t)基因的精细定位及候选基因的确定
　　利用籼粳杂交F2群体将相关基因AL13(t)定位于水稻第7染色体的2个Indel标记R8008和R1243之间，遗传距离分别为2.4cM和4.2cM。随后，利用新开发的Indel和CAPS标记，进一步将AL13(t)基因定位在R5840-4与RDraI56417之间，两个标记位于两个相互重叠的BAC上，物理距离约为87Kb，此区间内包含12个基因。测序结果表明，该区间含有的一个注释基因LOC_Os07g07620缺失了13个碱基，造成移码突变而失去正常功能。该基因编码一个三角状五肽(PPR)蛋白，近年来的研究表明，PPR基因在植物中大量存在，水稻基因组中有650个PPR基因，并且许多植物的幼苗失绿突变性状与PPR蛋白有关，因此，将该基因确定为al13(t)的候选基因。

目录

声明

摘要

第1章 文献综述

1．1 光合作用及其重要性

1．2 叶绿体的研究进展

1．2．1 叶绿体的形态结构

1．2．2 叶绿体的起源与进化

1．2．3 叶绿体基因及表达调控

1．3 水稻叶色突变体的综述

1．3．1 叶色突变形成的分子机制

1．4 水稻图位克隆技术

1．4．1 图位克隆技术原理

1．4．2 图位克隆的实验步骤

1．5 PPR蛋白及研究进展

1．5．1 PPR蛋白的分布

1．5．2 PPR蛋白的功能

前言

第2章 试验材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要器具

2．1．4 主要生物信息学软件及水稻相关数据库

2．2 实验方法

2．2．1 水稻光合指标的测定

2．2．2 叶绿体透射电子显微镜分析

2．2．3 基因组总DNA的提取

2．2．4 图位克隆与基因定位

2．2．5 候选基因的确定及序列分析

第3章 结果与分析

3．1 白化突变体al13(t)的表型鉴定

3．2 光合色素含量分析

3．3 突变体光合特性的研究

3．4 突变体叶绿体超微结构

3．5 遗传分析

3．6 利用图位克隆技术进行AL13(t)基因定位

3．6．1 AL13(t)基因初步定位

3．6．2 AL13(t)基因精细定位

3．7 候选基因确定及序列分析

第4章 讨论与结论

4．1 讨论

4．2 结论

参考文献

致谢

在校参加的科研课题及发表的论文