结核分枝杆菌表面蛋白PPE19在压力反应和毒力中的作用研究

摘要

结核病是一个全球范围的健康难题，全世界有三分之一的人感染结核病，并且每年以上百万的人数在增加。结核分枝杆菌是引起结核病的一类病原菌，它能侵犯人体的各个器官，但以肺部结核病最严重。尽管预防疫苗以及用于治疗结核病的抗结核菌药物不断出现，但是由于耐药性菌株的不断出现，以及结核病与HIV共感染，结核病目前仍然是威胁人类健康的主要传染病。
　　结核分枝杆菌在感染人体以及在巨噬细胞中成功的生存下来的过程中会面临来自机体的多种压力条件，其中包括由巨噬细胞产生的氧化压力，吞噬体产生的酸性压力，肺泡表面活性物质引起的表面结构的损伤，以及在肉芽肿以及吞噬体中的低氧环境和营养物质的缺乏。除此之外，分枝杆菌在传播过程中还会遭受到紫外的照射，脱水，以及低温等多种压力。结核分枝杆菌能够在这些环境中生存并适应下来，需要复杂的基因的调控。
　　结核分枝杆菌PPE家族基因因其在结核分枝杆菌与宿主间的相互作用中发挥重要的功能而越来越被重视。该家族基因主要参与结核分枝杆菌的毒力，作为抗原变异的来源，以及作为血清诊疗工具等发挥作用。通过文献调研，我们发现PPE家族的一个基因—PPE19，是结核分枝杆菌压力反应因子SigB的一个重要的调控子。SigB基因在细菌压力反应中发挥了重要的作用，sigB缺失菌株对类似SDS诱导的表面压力、氧化压力、热激以及万古霉素等均表现得更加敏感。我们推测PPE19作为SigB因子的一个调控子，可能也会在应对这些或其中某种压力环境中发挥一定的作用。
　　为了研究PPE19是否会在结核分枝杆菌应对环境压力中发挥作用，我们首先以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，对PPE19（Rv1361c）基因进行了克隆，并将其与带有Myc标签的穿梭质粒pNIT连接，获得pNIT-Rv1361c重组质粒，之后重组质粒转入生长速度较快且无毒力的耻垢分枝杆菌mc2155菌株中，成功构建了表达PPE19重组蛋白的重组耻垢分枝杆菌。通过分级分离以及蛋白酶K消化分析，应用Western-blotting技术检测了目的蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的定位。为了研究外源PPE19蛋白的过表达是否会对耻垢分枝杆菌的生长产生影响，我们检测了PPE19重组菌与只含有pNIT空载的耻垢分枝杆菌对照菌的生长曲线。为了解PPE19蛋白是否与结核分枝杆菌在多种压力环境下的存活相关，我们检测了PPE19重组菌以及空载菌在营养饥饿条件下，酸性条件，SDS引起的表面压力，由联氨诱导的氧化压力，以及抗生素（异烟肼，诺氟沙星），酸性NO等体外压力环境下的生长情况，同时检测了PPE19的过表达菌株在巨噬细胞内的存活以及对巨噬细胞的影响。
　　我们的研究结果表明，PPE19（Rv1361c or mtb39b）只存在于结核分枝杆菌的牛分枝杆菌中。尽管PPE19定位在细胞表面，但是并没有对耻垢分枝杆菌的表面特性如菌落形态，生物膜的形成等产生明显的影响。然而，PPE19的过表达增强了耻垢分枝杆菌在稳定期的生长，增加了对饥饿条件，酸性压力，表面压力，氧化压力以及异烟肼药物等多种压力环境的耐受。值得注意的是，尽管PPE19对多种压力条件产生耐受性，然而对于诺氟沙星和酸性NaNO2的处理却表现出一定的敏感性。尽管PPE19在应对体外多种压力环境时表现出截然相反的结果，然而在具有多重压力环境的RAW264.7巨噬细胞中，PPE19明显增强耻垢分枝杆菌的存活，但是没有明显改变细胞内相关细胞因子的转录水平。
　　通过本研究，证实了结核分枝杆菌PPE19蛋白在应对压力胁迫中发挥了重要作用，可能是通过改变细胞表面组分或参与维持遗传物质稳定性完成的。本研究将为PPE家族基因添加新功能，同时为进一步研究结核分枝杆菌免疫逃避的机制奠定了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 综述

1．1 引言

1．2 分枝杆菌Ⅶ型分泌系统简介

1．3 结核分枝杆菌ESX-5分泌系统的组成

1．3．1 ESX-5基因簇内的ESX核心组分

1．3．2 ESX-5基因簇内部的PE／PPE基因

1．3．3 ESX-5通道组分

1．3．4 ESX-5基因簇内其他基因

1．4 ESX-5的功能介绍

1．4．1 ESX-5分泌系统分泌多种蛋白

1．4．2 ESX-5分泌的效应分子激活巨噬细胞诱导炎性产生

1．5 目前已知的通过ESX-5分泌系统进行分泌的蛋白及可能的机制

1．5．1 目前已知的通过ESX-5分泌系统进行分泌的蛋白

1．5．2 ESX-5分泌模式及机制

1．6 总结和展望

第2章 前言

第3章 实验材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验菌株、载体和细胞

3．1．2 培养条件及培养基

3．1．3 实验所需试剂

3．1．3 试验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 结核分枝杆菌PPE19(Rv1361c)基因的扩增

3．2．1 Rv1361c PCR产物的回收

3．2．2 制备大肠杆菌感受态细胞

3．2．3 大肠杆菌的转化(热激法)

3．2．4 PPE19(Rv1361c)基因的TA克隆

3．2．5 重组质粒的提取

3．2．6 PPE19(Rv1361c)重组质粒的构建

3．2．7 PPE19(Rv1361c)重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

3．2．8 PPE19(Rv1361c)重组耻垢分枝杆菌的构建

3．2．9 PPE19(Rv1361c)重组蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位分析

3．2．10 过表达PPE19(Rv1361c)对耻垢分枝杆菌对SDS耐受的影响

3．2．11 过表达PPE19(Rv1361c)蛋白对耻垢分枝杆菌饥饿、酸性以及氧化压力的影响

3．2．12 过表达PPE19(Rv1361c)重组蛋白对耻垢分枝杆菌抗生素耐受的影响

3．2．13 过表达PPE19(Rv1361c)重组蛋白对耻垢分枝杆菌亚硝酸钠耐受的影响

3．2．13 Rv1361c对相关基因转录水平的影响

3．2．14 M．s-pNIT-Rv1361c重组菌侵染RAW264．7巨噬细胞后存活率检测

第4章 结果与分析

4．1 从基因组中扩增Rv1361c基因

4．2 构建BL21-pET-28(+)-Rv1361c重组大肠杆菌

4．2 PPE19(Rv1361c)重组蛋白在大肠杆菌BL21中的表达纯化

4．2 构建pNIT-Rv1361c重组耻垢分枝杆菌

4．3 pNIT(Myc)-PPE19重组蛋白在耻垢分枝杆菌中成功表达

4．4 PPE19定位在耻垢分枝杆菌细胞表面

4．5 PPE19对重组耻垢分枝杆菌菌落形态和生物膜形成没有明显影响

4．6 PPE19增强耻垢分枝杆菌在稳定期的生长

4．7 PPE19增强耻垢分枝杆菌在营养饥饿以及酸性条件下的存活

4．8 PPE19增强耻垢分枝杆菌对SDS的耐受

4．9 PPE19增强耻垢分枝杆菌对氧化剂联氨的耐受

4．10 PPE19增强耻垢分枝杆菌对异烟肼药物的耐受

4．11 PPE19增强耻垢分枝杆菌对诺氟沙星的敏感性

4．12 PPE19增强耻垢分枝杆菌对RNS的敏感

4．12 PPE19增强耻垢分枝杆菌在RAW264．7巨噬细胞中的存活

4．13 PPE19对巨噬细胞内细胞因子没有明显改变

第5章 结论与展望

5．1 实验结论

5．2 讨论分析

5．3 展望

参考文献

致谢

在学期间所发表的文章