调控内源生长素和细胞分裂素水平实现棉花种子-纤维产量和品质的同步改良

摘要

我国是世界上最大的原棉生产国和消费国，棉花在我国国民经济中占有重要地位。棉花的主要经济产物为纤维和棉花种子，纤维是最重要的纺织工业原材料，同时棉花种子作为副产品，也是重要的蛋白、食用油和生物燃料来源。棉纤维是从胚珠表皮细胞分化而来的单细胞，这一特性就决定了棉花种子与纤维发育之间不可分割的关系，然而两者之间为了争夺各自所需的光合产物存在着竞争关系。在传统育种中，伴随着选育品种纤维产量的提高，种子相对变小。纤维产量的提高往往是建立在以牺牲种子为代价基础之上的。种子变小会直接影响种子的生活力，使棉花纤维产量的进一步提高受到限制。因此，如何进一步提高棉花纤维的增产潜力，同时促进种子发育，实现纤维和种子的同步改良，对促进我国棉花相关产业的良性发展具有十分重要的意义。
　　由于棉花种质资源和常规育种技术的限制，大幅度同步提高纤维和种子产量变得越来越困难。运用基因工程手段能将优良基因进行定向转移，实现目标性状的改良，这为棉花品种的选育提供了新的途径。本实验室前期利用胚珠表皮特异启动子FBP7调控生长素合成基因iaaM的表达，在纤维细胞起始时期特异的积累IAA能够促进纤维起始细胞和成熟纤维数量增加，进而提高棉花纤维产量，同时伴随着纤维细度的增加，马克隆值降低，纤维品质得到改善，实现了棉花纤维产量和品质的同步改良，然而纤维产量提高的同时，种子的重量也有所降低。如何克服这一缺点，这是本研究需要解决的主要问题。棉花产量是通过植物各个组织器官之间的协同生长所决定的。光合作用和源组织的发育都受到库组织的调控，通过调控植株C/N平衡改变源/库平衡影响整个植株的生长。细胞分裂素作为一种植物激素，调控植物生长发育的各个方面，包括细胞的分裂分化、叶片衰老、微管发育、根系发育、生物和非生物性胁迫反应等过程。细胞分裂素还能够增加植物源组织中碳的固定和吸收，协调库和源组织的营养植物的运输和代谢，从而增大库的能力和强度，在果实及种子发育过程中提高座果率、促进果实种子中同化物的积累及胚乳发育。
　　细胞分裂素被认为是重要的种子产量调控因子。外源施用细胞分裂素复合物促进棉花籽棉产量和纤维产量提高，然而外源施用细胞分裂素工作量大，增加生产成本。利用基因工程调控棉花内源细胞分裂素水平，不仅可以阐明细胞分裂素在棉花生长发育中的作用，还可以改良棉花的纤维和种子产量。作为一种植物激素，细胞分裂素存在着合适的浓度范围。本研究首先通过离体培养，观察了细胞分裂素对胚珠发育的影响，结果表明，在适当浓度范围内细胞分裂素能促进胚珠体积的增大。为了提高植株内源细胞分裂素的水平，前人利用组成型启动子控制合成细胞分裂素限速基因ipt的表达，但转基因植株出现细胞分裂素过量导致的表型，如生长畸形和和不育等。本实验室曾尝试获得组成型启动子35S控制ipt的转基因棉花，但未获成功。细胞分裂素氧化酶(Cytokinin oxidase/dehydrogenase，CKX)是细胞分裂素代谢中的一个重要负调控因子，能催化细胞分裂素N6上不饱和侧链发生裂解，使之丧失活性，从而调节细胞分裂素的动态平衡。抑制CKX的表达可以提高植物的内源细胞分裂素水平，是一种“温和”的调节方式。本文利用不同启动子下调棉花CKX基因的表达，以期提高棉花种子的产量。进而通过杂交，实现基因聚合(Gene Stacking)定向改良转基因棉花，实现棉花纤维与种子的同步改良。
　　论文的主要结果如下:
　　1、适度抑制的35S∷Gh CKXRNAi转基因棉花生长正常
　　通过农杆菌介导遗传转化，获得了17个组成型下调GhCKX(35S∷GhCKXRNAi)转基因棉花株系。根据CKX的抑制程度，转基因棉花可分为三种类型:轻微抑制(GhCKX下调幅度小于30％)，适度抑制(下调幅度30-70％)和过度抑制（下调幅度大于70％）。轻微下调植株的表型与野生型无明显差异，而重度下调植株表现出典型的细胞分裂素过量的表型;植株矮化簇拥，叶片变小，花器官发育异常。适度下调植株的株高略有降低，花蕾和铃数增加，花瓣和子房变大，其它植株性状变化不大。
　　2、抑制GhCKX的表达提高了棉花内源细胞分裂素的含量
　　测定了35S∷GhCKXRNAi的适度抑制型和过度抑制型转基因株系幼茎、花蕾、胚珠、幼叶和成熟叶片中13种细胞分裂素含量。各个部位中IP、ZT、ZR和IPR等主要细胞分裂素含量均有提高。与野生型相比，适度抑制株系CR-3和CR-6，以及重度抑制株系CR-13的细胞分裂素总量分别提高了20.4％、55.5％和134.2％。内源细胞分裂素水平随着基因抑制程度的增加而提高。
　　3、抑制GhCKX的表达延迟了叶片衰老，提高了叶片的光合效率
　　适度抑制型CR-3和CR-6株系和重度抑制型株系CR-13在90DAS、105DAS和120DAS三个时期的上部、中部和底部叶片的叶绿素含量均高于野生型叶片，同时主茎叶片的脱落数量均低于同期的野生型。适度抑制型株系CR-3和CR-6的光合速率相比野生型分别增加了10.7％和12.2％。
　　4、适度抑制GhCKX表达促进了棉花种子发育，提高了棉花种子和纤维产量
　　根据GhCKX基因下调程度和株型观察，选取1个轻度抑制株系(CR-7)，5个中度抑制株系(CR-3、-4、-5、-6和-8)以及2个重度抑制系(CR-11和CR-13)，观察其农艺性状。5个中度抑制株系的单株铃数平均比对照提高了19.0％，铃重和种子百粒重也有所提高。值得注意的是，中度抑制株系的衣指（每100粒种子产生的纤维重量）也得到提高。表明，这些株系在种子重量增加的同时，纤维产量的同步提高。相反，重度抑制株系的铃数和铃重和纤维产量则明显降低;而轻度抑制系和对照相比没有明显差异。随机区组试验结果表明，适度下调GhCKX基因株系CR-6的小区籽棉产量提高17.2％，皮棉和种子产量分别增加20％和15.4％，均达到显著差异水平。而过度抑制GhCKX表达CR-13株系棉铃数减少，铃量降低，皮棉产量和种子产量均明显下降。纤维品质测定结果显示，适度提高内源细胞分裂素含量，对转基因棉花的纤维品质没有明显的负面影响。
　　5、种子特异启动子下调GhCKXR也促进了棉花种子的发育，提高了籽棉产量
　　多年观察统计结果表明，种子特异启动子Pv和D113下调GhCKX的株系多数生长正常。转基因株系铃数和铃重增加，种子百粒重平均分别增加了10.2％和6.5％，表明在种子中提高内源细胞分裂素含量，可以促进种子发育，提高籽棉产量。
　　6、FBP7∷iaaM和35S∷GhCKXRN Ai的聚合，保留了各自的优良特性、弥补了双方的不足，进一步提高了纤维和种子的产量
　　为克服胚珠表皮特异启动子调控生长素合成基因转基因棉花(FBP7∷iaaM)种子变小的缺点，通过常规杂交，实现FBP7∷iaaM和35S∷GhCKXRNAi的聚合(GeneStacking)，在分离世代(F4)鉴定出不分离的双基因纯合株系。双基因纯合株系的纤维和胚珠中生长素和细胞分裂素含量提高，光合作用增强，叶片延迟衰老，铃重和铃数提高，表现出适度下调GhCKX基因亲本CR-6株系的优良特征。种子百粒重分别比FBP7∷iaaM转基因棉花和野生型增加了14.8％和5.58％，种子的萌发率提高，有效地弥补了亲本FM-9种子变小的缺点;其根系发育达到野生型水平，克服了组成型抑制CKX导致根系发育受阻的缺点。同时，双基因纯合株系的纤维起始细胞数量和密度增加，成熟纤维数量提高，衣分和衣指分别相比野生型提高9.02％和17.85％，马克隆值降低，表现出亲本FM-9的优良性状。和单基因转基因棉花相比，双基因的聚合进一步提高了转基因棉花的纤维与种子产量，显示出很大的增产潜力。
　　上述研究结果表明，与IPT相比， CKX调节植物内源细胞分裂素含量上，作用更为温和。在组成型启动子控制下适度抑制该基因，也可获得生长正常的转基因植株。内源细胞分裂素含量的提高，延缓了叶片衰老，叶片光合效率提高，促进了种子发育，进而提高了种子产量。因此，CKX是一个很有应用价值的基因。通过基因聚合，可以将不同基因控制元件的优点结合在一起，弥补各自的不足，是实现作物分子设计育种和作物定向改良的有效途径。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 我国棉花现状

1．2 棉花产量构成因素

1．3 棉花纤维发育研究进展

1．3．1 棉花纤维起始发育

1．3．2 棉花纤维伸长发育

1．3．3 棉花纤维次生壁发育

1．3．4 利用基因工程改良棉花纤维长度和强度

1．4 棉花种子发育

1．5 细胞分裂素的特性

1．5．1 细胞分裂素的发现

1．5．2 细胞分裂素的合成

1．5．3 细胞分裂素的降解

1．5．4 细胞分裂素的运输

1．5．5 细胞分裂素的信号传导

1．5．6 细胞分裂素功能

1．6 细胞分裂素对棉花纤维的影响

1．7 生长素调控棉花纤维的发育

1．8 激素间的相互作用调控生长发育

1．8．1 生长素和细胞分裂素调控茎端分生组织的形成

1．8．2 生长素和细胞分裂素调控根系分生组织的发育

1．8．3 生长素和细胞分裂素调控叶序和侧芽的形成

1．8．4 生长素与细胞分裂素之间共同调控种子发育

1．9 基因聚合定向改良新品种

1．9．1 转基因聚合技术的研究

1．9．2 多基因聚合棉花推广利用

第二章 引言

2．1 研究意义及立题依据

2．2 技术路线

第三章 调控细胞分裂素水平促进棉花生长发育

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株和载体

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．1．5 主要缓冲液配方

3．2 方法

3．2．1 棉花RNA提取

3．2．2 cDNA合成

3．2．3 定量PCR反应

3．2．4 棉花中细胞分裂素含量分析

3．2．5 棉花叶片叶绿素含量分析

3．2．6 棉花叶片光合速率分析

3．2．7 棉花可溶性糖含量分析

3．2．8 棉花可溶性蛋白含量分析

3．2．9 棉花胚珠培养

3．2．10 测定根系长度

3．2．11 田间性状统计

3．3 结果与分析

3．3．1 体外添加细胞分裂素促进棉花胚珠发育

3．3．2 组成型下调细胞分裂素氧化酶基因表达促进棉花种子和纤维的发育

3．3．3 种子特异下调GhCKX的表达促进棉花种子增大

3．4 小结

3．4．1 下调GhCKX的转基因提高了柿花内源细胞分裂素的含量

3．4．2 与ipt相比，CKX在调控内源细胞分裂素上是个“温和”基因

3．4．3 组成型下调GhCKX基因的表达提高叶片叶绿素的含量；延迟叶片的衰老促进棉花檀株的光合作用，增加柿铃中物质的积累

3．4．4 适度下调GhCKX基因的表达促进纤维产量和种子产量的同步提高

3．4．5 种子中特异下调GhCKX促进棉花种子发育，子指增加

3．5 讨论

3．5．1 细胞分裂素促进棉花檀株生长，调控柿铃的发育存在剂量效应

3．5．2 不同类型细胞分裂素在棉花不同时期、不同组织中的含量与组分不同

第四章 调控内源生长素和细胞分裂素的基因聚合，实现种子-纤维产量和品质同步改良

4．1 材料

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株和载体

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器设备

4．1．5 主要缓冲液配方

4．2 方法

4．2．1 棉花RNA提取

4．2．2 cDNA合成

4．2．3 PCR扩增

4．2．4 定量PCR反应

4．2．5 IAA和CKs含量测定

4．2．6 开花当天胚珠电镜扫描

4．2．7 成熟纤维计数

4．2．8 种子可溶性糖含量测定

4．2．9 棉花叶片光合速率分析

4．2．10 种子含油率测定

4．2．11 种子萌发

4．2．12 测定根系长度

4．2．13 田间性状统计

4．3 结果与分析

4．3．1 亲本FBP7∷iaaM-9的特征

4．3．2 亲本35S∷GhCKXRNAi-6的特征

4．3．3 亲本Pv∷antisenseGhCKX-13的特征

4．3．4 亲本D113∷antisenseGhCKX-43的特征

4．3．5 聚合FBP7∷iaaM-9和35s∷GhCKXRNAiAi-6后代性状

4．3．6 聚合FBP7 ∷iaaM-9和Pv∷antisenseGhCKX-13双载体后代性状

4．3．7 聚合FBP7∷iaaM-9和D113∷antisenseGhCKX-43后代性状

4．3．8 FBP7∷iaaM-9×Pv∷antisenseGhCKX-13／D113∷antisenseGhCKX-43的F3代性状分析

4．4 结论

4．4．1 三种不同启动予下调GhCKX的棉花与FBP7∷iaaM-9的基因聚合弥补亲本FBP7∷iaaM-9子指偏低的缺陷

4．4．2 基因聚合进一步提高了棉花纤维和种子的产量，同时改进了纤维的细度

第五章 讨论

5．1 CKX是调控内源细胞分裂素水平的理温和基因，在提高种子产量的基因工程育种中有重要利用价值。

5．2 细胞分裂素提高棉花植株的光合作用效率，延迟叶片的衰老，增加棉铃中物质的积累。

5．3 细胞分裂素促进棉花生殖器官的发育

5．4 三种不同启动子的比较

5．5 生长素的分布与纤维一胚胎发育

5．6 棉花胚珠中适时／适度的调控生长素和细胞分裂素水平可以在增加棉花纤维产量的同时促进种子发育

第六章 主要结论和创新点

6．1 主要结论

6．2 创新点

参考文献

附录

附录3：发表文章

致谢