犬氧化损伤性白内障晶体状结构和转化生长因子β1mRNA表达的变化

摘要

目的:本试验旨在探索犬氧化损伤性白内障发病进程中晶状体结构和转化生子因子β1(TGF-β1) mRNA表达的关系。
　　方法:(1)选择36只健康的重庆本地杂交犬（5～6kg），随机分成试验组和空白对照组两组，其中30只犬作为试验组，6只为空白对照组。其中试验组犬采用Fenton溶液进行晶状体囊袋内注射法建立犬白内障模型。每日使用裂隙灯观察犬白内障的成模情况，根据裂隙灯的检查结果并参照国际分级标准LOCSⅢ和Kador等将晶状体混浊度分级并略作修改，将犬白内障的发展程度分成Ⅰ～Ⅳ期。(2)分别选取3只正常对照组和15只试验组犬眼的晶状体制作HE染色切片，借助光镜观察晶状体病理组织变化。(3)取3只空白对照组犬晶状体并对目的基因TGF-β1和内参基因GAPDH进行RT-QPCR(real-timequantitative PCR)后，获得符合荧光定量PCR条件所需的标准曲线、熔解曲线和扩增曲线，用于犬TGF-β1和GAPDH基因在晶状体表达研究。选择15只试验犬为研究对象，分别选取犬白内障Ⅰ～Ⅴ期的晶状体进行RT-QPCR检测，最后采用△△Ct法分析晶状体组织中TGF-β1基因的相对表达量。
　　试验结果:(1)试验组的60只犬眼经过4～6天后，散瞳可见晶状体周边部皮质出现细小囊泡或细小囊泡群形成，即为白内障Ⅰ期;9～11天散瞳后晶体周边空泡自赤道部向前皮质扩展，在周边前或后皮质逐渐形成环状或戒指状混浊,不影响观察眼底，形成白内障Ⅱ期;14～18天不散瞳即可见到晶状体皮质区有放射状的混浊，慢慢形成灰白色混浊，通过混浊区眼底细节不清楚，形成白内障Ⅲ期;22～23天晶体皮质混浊区融合，可见到新月形投影或水裂，混浊区眼底细节不可见，形成白内障Ⅳ期;25～30天晶状体皮质及核完全呈灰白色混浊，遮蔽眼底形成白内障Ⅴ期，即成熟白内障期。整个白内障模型的形成过程中空白对照组的犬晶状体始终透明澄澈。(2)组织病理学结果显示:观察正常晶状体切面，可见前囊膜下有一单层立方形晶状体上皮细胞(LECs)大小较均匀，形态一致，细胞染色均匀，细胞圆且居中，细胞之间连接紧密。在犬白内障的形成过程中观察到从Ⅰ期起晶状体前囊膜下LECs排列紊乱，大小不一，细胞核染色不均匀且数量减少，当发展到Ⅲ、Ⅴ期时LECs与前囊膜连接明显疏松，Ⅴ期时前囊膜最终破裂;正常晶状体的后囊膜下无LECs分布且囊膜形态规则完整。当犬白内障由Ⅲ期向Ⅴ期发展时后囊膜形态结构出现改变，囊膜与皮质区连接疏松，最终在白内障Ⅴ期时后囊膜变得不完整，说明后囊膜破裂;正常晶状体赤道部的上皮细胞分化活跃，可以见到较多未成熟晶状体细胞的细胞核且晶状体纤维无论是在深皮质区或是浅皮质区的排列都是紧密有序，通过观察可见犬白内障发展从Ⅰ期时赤道部的LECs数量开始逐渐减少，到Ⅴ期时LECs已经很少了，细胞核染色不均且深，在Ⅴ期时可见赤道部皮质区周围的晶状体纤维之间有缝隙，呈现出连接疏松，甚至出现断裂崩解，走向改变的现象。(3)犬白内障发展的五个时期中TGF-β1mRNA的表达量均有增加。犬白内障Ⅰ期时TGF～β1mRNA表达量是空白对照组的1.29倍，Ⅱ期时TGF-β1mRNA表达量是空白对照组的2.72倍，Ⅲ期时TGF-β1mRNA的表达量是空白对照组的2.82倍，达到最高，Ⅳ期时TGF-β1 mRNA的表达量是空白对照组的1.75倍，Ⅴ期时TGF-β1mRNA的表达量是空白对照组的1.25倍。与空白对照组相比犬白内障发展中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的TGF-β1mRNA的表达水平都上调，差异极其显著(p＜0.01)，其中以Ⅲ期最高，Ⅱ期其次。且Ⅲ期和Ⅱ期表达水平显著高于其它白内障发展的三个时期(p＜0.05)，Ⅲ期和Ⅱ期之间的表达水平差异不显著(p＞0.05)，Ⅰ期和Ⅴ期之间的表达水平差异不显著(p＞0.05)。
　　结论:(1)采用Fenton溶液在晶状体囊袋内注射建立犬氧化损伤性白内障模型的方法，操作方便，经济实用，显效快，可在一个月之内成功建立理想的犬白内障模型。(2)犬氧化损伤性白内障发展中TGF-β1mRNA的高表达与晶体上LECs的异常变化、囊膜的完整性遭到破坏有关。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 晶状体的组织结构与生理功能

1．2 白内障的研究现状

1．3 TGF-β在眼科的研究进展

第二章 引言

第三章 犬氧化损伤性白内障模型的建立

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．3 试验结果

3．4 分析与讨论

第四章 犬氧化损伤性白内障晶状体结构变化和TGF-β1mRNA表达变化的研究

4．1 试验材料

4．2 试验方法

4．3 试验结果

4．4 分析与讨论

第五章 全文总结及创新点

5．1 全文总结

5．2 创新点

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间论文发表情况