BmGem1和BmGem2在家蚕细胞中的功能鉴定

摘要

细胞周期活动是一个普遍而又非常复杂的级联调控过程，它与细胞的增殖和分化、DNA的损伤和修复以及个体的发育、器官的形成、坏死组织的再生和疾病的发生密切相关。多细胞生物的正常发育依赖于细胞增殖及分化的一系列严密调控过程，研究表明多种蛋白在这一过程中起着非常重要的作用。Geminin蛋白就是其中一种，它是1998年首先在爪蟾卵的抽提物中被鉴定到的一个不稳定小分子核蛋白。Geminin包含一段特殊的coiled-coil超螺旋二级结构，通过竞争性结合DNA复制起始因子Cdt1或多种参与细胞分化的转录调控因子，调控个体发育过程中细胞的增殖和分化。目前，Geminin作为偶联细胞增殖与分化的一个关键的周期调控因子已经成为研究热点。本研究在本实验室已克隆并鉴定的两个家蚕Geminin基因，BmGem1和BmGem2以及复制起始因子BmCdt1的基础上，利用免疫共沉淀、双分子荧光互补技术、基因干扰和过表达技术以及酵母双杂交技术等多种分子细胞生物学研究方法对其在细胞中的功能展开深入的研究，这将为家蚕细胞周期调控的研究奠定基础，并且能够丰富细胞生物学相关理论。获得的主要研究结果如下:
　　1.BmGem1、BmGem2与BmCdt1之间的相互作用关系
　　本研究通过双分子荧光互补技术(BiFC)和免疫共沉淀(Co-IP)的方法对BmGem1、BmGem2以及BmCdt1蛋白之间的相互作用关系进行检测。在家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1中BiFC和Co-IP结果表明:BmGem1和BmGem2在细胞核中自身都能相互作用，并且BmGem1和BmGem2之间也存在相互作用;在细胞核中BmGem1能与BmCdt1发生相互作用，而BmGem2不能与BmCdt1发生相互作用，但是BmGem2能在细胞质中与BmCdt1发生相互作用。另外，Co-IP检测结果显示:当BmGem1、BmGem2和BmCdt1在家蚕BmN-SWU1细胞中共同转染时，在细胞质中BmGem1与BmGem2都能与BmCdt1发生相互作用，不存在相互竞争结合的关系，在细胞核中BmGem1与BmCdt1能发生相互作用，而BmGem2不能与BmCdt1相互作用。这些研究结果表明，BmGem1是家蚕细胞直接与BmCdt1相互作用的 Geminin蛋白直系同源物，而BmGem2在细胞周期调控中的作用以及执行的功能的分子机制可能与Geminin蛋白存在差异。
　　2.BmGem1和BmGem2干涉对家蚕细胞的影响
　　利用基于家蚕miRNA-based的RNAi载体在家蚕卵巢细胞系BmN4细胞中对BmGem1和BmGem2表达进行敲降。qRT-PCR检测结果表明BmN4细胞中转染BmGem1RNAi载体后，在对照组(conlRNAi)BmGem1和BmGem2基因表达量为1的基础上， BmGem1的mRNA水平下降为0.39±0.01，BmGem2的mRNA水平则升高为1.28±0.01;而转染BmGem2 RNAi后在对照组(con2RNAi) BmGem2和BmGem1基因表达量为1的基础上，qRT-PCR检测结果表明BmGem2的mRNA水平下降为0.61±0.07，BmGem1的mRNA水平则升高为1.66±0.04，同时干涉BmGem1和BmGem2后在对照组(conRNAi) BmGem1和BmGem2基因表达量为1的基础上，qRT-PCR检测结果表明BmGem1的mRNA水平下降为0.78±0.05，BmGem2的mRNA水平下降为0.68±0.06，这些研究结果表明两者之间存在一定的剂量补偿的关系，暗示两个蛋白虽然与BmCdt1作用机制存在差异，但在家蚕细胞中的功能仍然存在一定关联。
　　BmN4细胞中BmGem1干涉后细胞体积明显的增大，统计分析结果表明BmGem1干涉组中有58.35％左右的细胞体积增大，对照组中仅有5.24％左右的细胞体积增大的细胞;BmGem2干涉组中未发现有明显的细胞体积增大的现象;但是同时干涉BmGem1和BmGem2后细胞体积增大的现象更为显著，达到被干涉细胞的87.35％左右，显著高于BmGem1单独干涉组。细胞增殖活性检测结果显示BmGem1干涉的家蚕细胞中细胞增殖活性下降了36％左右，而BmGem2干涉的BmN4细胞中细胞增殖活性没有明显的变化;Bm Gem1和BmGem2共同干涉后细胞的增殖活性下降了53％左右，与BmGem1单独干涉组相比增殖活性显著下降。另外，流式细胞检测结果表明，BmGem1干涉后诱发DNA重复复制现象，而BmGem2干涉则不能诱发这种现象。并且与单独干涉BmGem1相比，BmGem1和BmGem2共同干涉后诱发家蚕细胞DNA重复复制现象更显著。说明BmGem1蛋白在家蚕细胞中能与BmCdt1蛋白直接相互作用调控细胞中DNA复制的起始，细胞缺失BmGem1表达诱发DNA重复复制的发生，致使细胞核体积变大;BmGem2不能与BmCdt1直接相互作用，其缺失表达并不会导致细胞周期进程中DNA重复复制;而两者同时缺失时抑制细胞增殖和诱发DNA重复复制能力增强，暗示BmGem2仍然参与调控细胞周期的相关过程，但BmGem2在细胞周期调控中的作用能够被BmGem1替代。
　　3.BmGem1和BmGem2过表达对家蚕细胞的影响
　　在BmN4细胞中分别过表达BmGem1和BmGem2基因后，荧光显微镜下观察单个细胞形态无明显的变化;但是BmGem1过表达组与对照相比细胞密度明显下降，细胞增殖活性检测结果表明细胞增殖活性下降了40％左右;而BmGem2过表达后对细胞增殖活性没有明显的变化;细胞流式结果表明，BmGem1过表达后G1期的细胞数目没有明显的变化，S期的细胞数目显著增加，G2/M期的细胞数目则显著降低;而BmGem2过表达后各个时期的细胞数目都没有明显的变化。这表明BmGem1过表达使细胞周期阻滞在S期，而不能进入G2/M期，过表达BmGem2对细胞周期没有明显的影响。
　　BmN4细胞转染BmGem1和BmGem2过表达载体后利用Brdu标记DNA复制起始情况，免疫荧光检测结果显示过表达BmGem1的细胞中具有DNA复制活性的细胞为0.16±0.09，对照组细胞为0.51±0.07，BmGem1过表达细胞的DNA合成活性显著降低;而过表达BmGem2的DNA合成活性没有显著差异。过表达研究结果表明，BmGem1在家蚕细胞周期进程中起着关键作用，BmGem1过表达阻滞细胞周期进行并抑制细胞增殖;而BmGem2在细胞周期调控中的作用较弱，它的过表达对细胞周期进行及细胞增殖无显著影响。
　　4.BmGem2相互作用蛋白的筛选及鉴定
　　我们的前期研究结果显示，BmGem2在DNA复制起始及细胞周期调控中的作用与BmGem1蛋白存在显著差异，为了精确分析BmGem2在家蚕细胞中执行的相关功能，我们通过酵母双杂交技术鉴定家蚕中与BmGem2相互作用的蛋白。利用胚胎期、5龄第3天、游走期以及化蛹期的整蚕的总RNA构建家蚕酵母双杂交文库。并以BmGem2为诱饵蛋白，通过酵母双杂交技术共筛选获得能够与BmGem2发生相互作用的阳性克隆34个，分别编码23个基因，剔除这23个基因中因重组cDNA造成的移码错义的基因，最终我们获得阳性克隆数是12个，随后我们对这12个基因进行克隆鉴定。通过双重免疫荧光检测和免疫共沉淀方法，最终鉴定到4个基因（17号，21号，38号，39号）分别能够与BmGem2共定位且产生相互作用。
　　生物信息学分析结果显示，17号和39号基因编码的蛋白是家蚕中特异的蛋白，序列分析结果显示在其它物种中未鉴定到其同源物。而21号基因编码的蛋白是果蝇中Centrosomin蛋白的同源物，因此将21号基因命名为Bmcnn，研究表明Centrosomin参与细胞骨架调控并对于染色体结构稳定起着很重要作用，qRT-PCR检测结果显示Bmcnn在家蚕5龄第3天正在进行高强度有丝分裂的精巢和卵巢中高表达，而在核内有丝分裂旺盛的丝腺中几乎不表达，推测BmGem2可能与细胞染色体结构的调控有关。39号基因编码的蛋白是哺乳动物核糖体生物合成调控蛋白RRS1的同源物，将39号基因命名为BmRRS1，qRT-PCR检测结果显示BmRRS1在家蚕5龄第3天的各个组织都有表达，且在精巢、卵巢和丝腺中表达量较高，推测BmGem2可能与核糖体生物合成调控有关。这些研究结果表明，Geminin基因在鳞翅目中特异扩增产生的BmGem2的功能已经发生分化，其在细胞中对于DNA复制及细胞周期进程的调控作用可能已经减弱，而执行调控染色体结构稳定及核糖体生物合成等新功能。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 细胞周期概述

1．2 细胞周期的调控

1．2．1 细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶

1．2．2 细胞周期调控因子对周期的调控

1．2．3 DNA复制起始的调控

1．3 细胞周期因子Geminin的功能

1．3．1 Geminin蛋白

1．3．2 Geminin蛋白的结构域

1．3．3 Geminin在复制起始中的功能

1．3．4 Geminin在细胞周期中的作用

1．4 脊椎动物Geminin相似蛋白与细胞周期调控

第二章 引言

2．1 研究背景与目的意义

2．2 主要研究内容

2．3 技术路线

第三章 BmGem1，BmGem2与BmCdt1之间的相互作用

3．1 材料与方法

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂及溶液配制

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要实验方法及步骤

3．2 结果与分析

3．2．1 BiFC分析BmGem1、BmGem2和BmCdt1之间的相互作用

3．2．2 免疫共沉淀分析BmGem1和BmGem2之间的相互作用

3．2．3 免疫共沉淀分析BmGem1，BmGem2与BmCdt1的相互作用

3．3 讨论

第四章 BmGem基因干涉对家蚕细胞影响

4．1 材料与方法

4．1．1 家蚕细胞系

4．1．2 主要试剂及溶液配制

4．1．3 主要仪器

4．1．4 主要实验方法及步骤

4．2 结果与分析

4．2．1 干涉质粒载体构建

4．2．2 基因干涉效果检测

4．2．3 BmGem基因干涉后家蚕细胞体积大小的变化

4．2．4 BmGem基因干涉对细胞增殖活性的影响

4．2．5 BmGem基因干涉对细胞周期和DNA含量的影响

4．3 讨论

第五章 BmGem基因过表达对家蚕细胞的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 家蚕细胞系

5．1．2 主要试剂及溶液配制

5．1．3 实验所需引物

5．1．4 主要实验方法及步骤

5．2 结果与分析

5．2．1 BmGem基因过表达载体的构建

5．2．2 BmGem1和BmGem2融合蛋白在家蚕细胞中的亚细胞定位

5．2．3 BmGem过表达在家蚕细胞中相对表达量分析

5．2．4 过表达BmGem基因对细胞形态的影响

5．2．5 过表达BmGem基因对细胞增殖活性的影响

5．2．6 过表达BmGem基因对细胞周期的影响

5．3 讨论

第六章 BmGem2相互作用蛋白的筛选及鉴定

6．1 材料

6．1．1 家蚕及家蚕细胞系

6．1．2 主要试剂及溶液配制

6．2 主要实验方法及步骤

6．2．1 RNA提取

6．2．2 mRNA的分离

6．2．3 DSN均一化Uncut cDNA初级文库的构建

6．2．4 pGADTT-DEST酵母双杂交文库的构建

6．2．5 酵母双杂交筛选BmGera2相互作用蛋白

6．2．6 酵母双杂交文库筛选

6．2．7 新基因克隆及载体构建

6．2．8 其它实验步骤参照第三，四，五章节

6．3 结果与分析

6．3．1 家蚕DSN均一化酵母双杂交cDNA文库(三框型)构建

6．3．2 pGBKT7-BmGem2诱饵载体的构建

6．3．3 pGBKT7-BmGem2诱饵载体自激活检测

6．3．4 酵母双杂交阳性克隆鉴定

6．3．5 酵母阳性克隆质粒提取和测序比对

6．3．6 BmGem2相互作用蛋白的验证

6．3．7 新基因在5龄第3天家蚕各组织中的相对表达分析

6．4 讨论

第七章 综合与结论

论文创新点

参考文献

附录

在读期间发表论文及参研课题

致谢