基于DNA扩增信号放大检测环境重金属离子适体生物传感器研究

摘要

重金属离子在环境中具有富集性、长久性、广泛性和严重性，其污染越来越引起大家的关注和重视，而发展及时、简单、准确、高灵敏和高选择性的测定环境中重金属离子浓度方法是预防、控制和处理重金属污染的基础、前提甚至是关键环节。与传统的重金属离子分析检测方法相比，电化学和电致化学发光适体传感器兼备了电化学、电致化学发光分析和适体的优点，具有检测及响应速度快、操作简便、特异性强、灵敏度高等优势，在重金属离子检测分析领域有较大的应用可行性，是当前最具应用前景的检测方法之一。目前，单纯利用适体结合目标物前后构象变化引起信号的增强或减弱，在进一步提高灵敏度方面已经十分有限。因此，为了进一步提高适体生物传感器的灵敏度，实现痕量检测重金属离子，需要采用一些信号放大策略。杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)是一种可在常温下进行反应，不需要控制温度变化和其他催化酶的辅助，仅依靠一对交叉互补的寡核苷酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)探针便可对目标物进行放大检测的扩增信号放大方法，它为构建简单、高灵敏电化学(Electrochemical，EC)和电致化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)适体传感器用于重金属离子检测提供了可能。基于此，本论文以HCR为基本放大策略，结合仿酶催化信号放大等构建了一系列EC和ECL适体传感器，旨在构建系列简单、可靠、快速、高灵敏和高选择性的适体生物传感器用于同一敏感界面一种或多种重金属离子的检测，并采用加标回收法或对环境样品进行检测对其初步应用进行研究。围绕本研究目的本文主要从EC和ECL适体生物传感器敏感界面的构建，重金属离子与碱基的特异结合性及仿酶催化和新型DNA扩增信号放大策略等方面进行了探索和研究。具体的研究内容如下:
　　(1)卟啉铁/G-四分体是由卟啉铁及一段富含鸟嘌呤G碱基的核苷酸组合而成的复合物，对电子传递具有一定的阻碍作用。因此，以铁氰化钾([Fe(CN)6]4-/3-)为氧化还原探针，结合HCR在电极表面原位产生卟啉铁/G-四分体DNA纳米线用于信号放大构建了一种简单、快速的电化学交流阻抗(Electrochemical ImpedanceSpectroscopy，EIS)适体传感器用于Ag+的高灵敏检测。在有目标物Ag+存在时，Ag+与富含胞嘧啶C碱基的捕获DNA探针和溶液中的引物DNA产生错配形成稳定的C-Ag+-C复合物，从而将引物DNA成功修饰于电极表面引发HCR形成卟啉铁/G-四分体DNA纳米线。由于卟啉铁/G-四分体DNA纳米线能够有效阻碍电极表面电子传递，得到增大的交流阻抗值，根据阻抗值的增大就可以完成对目标物的定量检测。该制备的传感器构建简单、灵敏度高、抗干扰能力强、重现性及稳定性优良。实验表明，该传感器对Ag+具有较宽的检测范围和较低的检测限:线性范围为0.1 nM～100μM，检测限为0.05 nM。与其他一些已报道的适体传感器相比较，该制备的传感器在灵敏度和线性范围等性能指标上都明显优于对比传感器，说明卟啉铁/G-四分体DNA纳米线能有效阻碍电子传递，得到增强的交流阻抗值。此外，还通过加标回收法对所制备的传感器初步应用进行了研究，回收率在90.1％至108.0％之间，结果较为理想，表明所制备的传感器具有潜在的应用价值，有望应用于环境中重金属离子的定量检测。
　　(2)卟啉铁/G-四分体除了具有一定阻碍电子传递的作用，还可以模拟辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)活性催化过氧化氢水解，且我们在研究中发现电致化学发光分析方法比电化学方法更为灵敏。因此，本文结合HCR在电极表面原位产生卟啉铁/G-四分体DNA纳米线，利用卟啉铁/G-四分体模拟HRP酶活性催化鲁米诺发光构建了一种新型电致化学发光适体传感器用于Ag+的高灵敏检测。首先将富含C碱基的捕获DNA探针组装在电沉积纳米金(dep Au)修饰的玻碳电极表面。通过碱基的特异性互补配对，将引物DNA链组装在电极上作为HCR的引发链，从而在电极表面原位产生大量的卟啉铁/G-四分体DNA纳米线用于模拟HRP活性。在含有H2O2和鲁米诺的测试底液中，卟啉铁/G-四分体呈现良好的HRP模拟酶活性，迅速催化H2O2产生大量的自由基(ROSs)，促进鲁米诺发光，得到增强的电致化学发光响应信号。当目标物Ag+存在时，Ag+与相邻的两条捕获DNA探针错配形成稳定的C-Ag+-C复合结构，从而使得卟啉铁/G-四分体纳米线离开电极表面，卟啉铁/G-四分体固载量减少，得到降低的电致化学发光响应信号用于定量检测Ag+。该传感器具有较高的灵敏度和良好的选择性:线性范围为2 pM～20μM，检测限达到0.67 pM。与前一个体系所构建的电化学交流阻抗适体传感器相比，其线性范围明显变宽，检测限更低，有望实现对环境中重金属离子的痕量检测。
　　(3)卟啉锰（MnTMPyP）是一种典型的以锰离子为中心原子的卟啉类化合物。它能直接镶嵌于AT或CG碱基对沟槽中，并呈现出良好的辣根过氧化物酶HRP活性，快速催化过氧化氢水解。与之前常用的具有HRP催化活性的卟啉铁/G-四分体相比，卟啉锰修饰在DNA双链中不需要特定的DNA序列。而且，由于卟啉锰能直接镶嵌于AT或CG碱基对沟槽中，其在DNA双链中的固载量大大增加，为构建简单、高灵敏、高催化效率的电化学传感器提供了可能。在这个体系中，结合HCR在电极表面原位产生DNA纳米线用于共固载卟啉锰、硫堇，利用卟啉锰模拟HRP酶活性催化信号放大，构建了一种新型电化学适体传感器用于汞离子(Hg2+)的定量检测。富含T碱基的捕获DNA探针首先通过Au-S键作用组装于纳米金(nano-Au)修饰的玻碳电极(GCE)表面。接着，引物DNA链通过碱基互补配对被修饰于电极表面以引发HCR，在电极表面生成卟啉锰/硫堇共固载的DNA纳米线。在检测底液中存在H2O2时，修饰在DNA纳米线上的卟啉锰模拟HRP活性，催化H2O2水解，从而促进电子媒介体硫堇的氧化还原反应，得到放大的电化学响应信号。当有目标物Hg2+存在时，Hg2+诱导相邻的捕获DNA探针形成T-Hg2+-T复合物，从而将卟啉锰/硫堇共固载的DNA纳米线解离电极表面，得到减小的电化学信号以实现对Hg2+的定量检测。结果表明，所构建的电化学适体生物传感器对其他金属离子具有较强的抗干扰性，对Hg2+表现出较高的灵敏度、优良的选择性和较低的检测限:线性范围为5 pM～50μM，检测限达到2.5 pM。
　　(4)一般构建的传感器大多只能检测一种重金属离子，而在环境中有可能存在多种重金属离子的污染。因此，构建一种传感器能同时检测多种重金属离子具有非常重要的意义，因为它能大大缩短分析时间，降低检测成本并提高检测效率。本章节结合HCR在电极表面原位产生DNA纳米线用于信号放大，利用不同电活性物质在同一缓冲液中出现不同出峰电位，构建了一种简单、快速、多组分检测的电化学适体传感器用于实现同一敏感界面Ag+和Hg2+同时检测。两条DNA单链首先自组装在金纳米粒子修饰的电极表面，一条是巯基修饰的富含C碱基的DNA链(C1)，能与互补的DNA链(P1)部分杂交，另一条是巯基修饰的富含T碱基的DNA链(C2)，能与互补的DNA链(P2)部分杂交(P1和P2分别为对应的引物DNA链)。紧接着加入四条辅助的DNA链（蒽醌-2-羧酸标记的LS1和LS2以及硫堇标的LS3和LS4）进行HCR反应，在电极表面原位生成分别含有大量蒽醌-2-羧酸和硫堇修饰的DNA纳米线。采用蒽醌-2-羧酸标记的DNA纳米线在-0.45V电位下检测Ag+和硫堇标记的DNA纳米线在-0.2V电位下检测Hg2+。在没有目标物Ag+和Hg2+时，高的蒽醌-2-羧酸和硫堇的信号都能被检测到。然而，在只有Ag+存在时，电极表面的C1发生错配形成发夹结构，使得蒽醌-2-羧酸标记的DNA纳米线离开电极表面，得到降低的电化学信号，硫堇信号值远比蒽醌-2-羧酸的信号大。当只有Hg2+存在时，电极表面的C2发生错配形成发夹结构，使得硫堇标记的DNA纳米线离开电极表面，-0.2V的硫堇信号远远低于-0.45V的蒽醌-2-羧酸信号。Ag+和 Hg2+同时存在时，蒽醌-2-羧酸和硫堇的信号值都很低，根据相应应电化学信号的减小就可以完成同一敏感界面两种重金属离子的同时定量检测。所构建的传感器构建简单、灵敏度高、能够用于Ag+和Hg2+的同时检测而不互相干扰，大大缩短了重金属离子分析时间，降低了检测成本并提高了检测效率。实验结果表明，所制备的传感器对Ag+线性范围为0.01nM～5μM，检测限达2pM，对Hg2+线性范围为0.05 nM～0.05 mM，检测限达7.5pM。

目录

声明

论文说明

摘要

第1章 绪论

1．1 重金属及其污染概述

1．1．1 重金属污染及特征

1．1．2 银在环境中的污染及影响

1．1．3 汞在环境中的污染及危害

1．2 常用的重金属离子检测方法及其比较

1．2．1 光谱法

1．2．2 质谱法

1．2．3 色谱法

1．2．4 比色法

1．2．5 电化学法

1．2．6 生物传感器

1．2．7 交叉综合法

1．3 适体和适体生物传感器

1．3．1 适体及其特征概述

1．3．2 适体与重金属离子的结合作用

1．3．3 适体生物传感器及其原理

1．3．4 适体生物传感器优势

1．3．5 适体生物传感器的分类

1．4 DNA扩增信号放大技术

1．4．1 聚合酶链式反应(PCR)

1．4．2 重组酶聚合酶扩增(RPA)

1．4．3 滚环扩增(RCA)

1．4．4 环介导等温扩增(LAMP)

1．4．5 杂交链式反应(HCR)

1．5 本论文的选题背景与意义、研究目的、研究思路和内容

1．5．1 选题背景与意义

1．5．2 研究目的和思路

1．5．3 研究内容

第2章 基于卟啉铁／G-四分体纳米线信号放大阻抗型适体传感器用于银离子检测研究

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂与材料

2．2．2 仪器

2．2．3 Ag+电化学适体传感器制备过程

2．2．4 电化学阻抗法检测Ag+原理

2．3 结果与讨论

2．3．1 传感器组装过程的EIS表征

2．3．2 不同放大策略传感器性能对比

2．3．3 适体传感器的分析性能研究

2．3．4 电化学适体传感器选择性、重现性及稳定性性能分析

2．3．5 适体传感器用于环境水样中Ag+浓度初步检测研究

2．4 结论

第3章 基于卟啉铁／G-四分体纳米线催化放大ECL适体传感器用于银离子检测研究

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂和材料

3．2．2 仪器

3．2．3 传感器表面修饰

3．2．4 目标物Ag+检测原理

3．3 结果和讨论

3．3．1 传感器的电化学表征

3．3．2 实验条件的优化

3．3．3 电致化学发光适体传感器的分析性能研究

3．3．4 ECL适体传感器的选择性、重现性及稳定性性能分析

3．3．5 适体传感器用于环境样品的初步测定研究

3．4 结论

第4章 基于卟啉锰、硫堇共固载纳米线催化信号放大电化学适体传感器用于汞离子检测研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂和材料

4．2．2 仪器

4．2．3 传感器制备过程

4．2．4 目标物H92+检测原理

4．3 结果和讨论

4．3．1 传感器表面电化学表征

4．3．2 传感器拉曼表征

4．3．3 卟啉锰催化放大性能研究

4．3．4 传感器的实验条件的优化

4．3．5 传感器分析性能研究

4．3．6 传感器的选择性、重现性和稳定性测试

4．3．7 适体传感器用于环境水样初步测定研究

4．4 结论

第5章 DNA纳米线标记不同电活性物质实现同一敏感界面两种离子同时检测适体传感器研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 试剂和材料

5．2．2 仪器

5．2．3 不同电活性物质标记的DNA链制备过程

5．2．4 传感器表面修饰

5．3 结果和讨论

5．3．1 传感器表面电化学表征

5．3．2 传感器的多目标物检测性能研究

5．3．3 电化学适体传感器的分析性能研究

5．3．4 传感器的选择性、重现性和稳定性测试

5．3．5 适体传感器用于环境水样初步测定研究

5．4 结论

第6章 结论与展望

6．1 本文主要结论

6．2 本文创新点

6．3 不足与展望

参考文献

致谢

在学期间所发表的文章和参与的课题