家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究——家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16和NbOTU1的鉴定及功能分析

摘要

为了推动微孢子虫孢壁形成机制的研究，进一步对微孢子虫孢壁中的其它蛋白成分，特别是对具有特殊序列特征和结构域的孢壁蛋白展开研究就显得尤为必要。有鉴于此，本文通过基因组扫描获得一批可能与家蚕微孢子虫侵染和免疫逃避相关的潜在孢壁蛋白，并对其中两个候选蛋白开展了较为深入的研究，其中一种为具有串联重复序列特征的蛋白NBO_29g0021(NbHSWP16)，另一种为具有otubain结构域和去泛素化蛋白酶活性的蛋白NBO_53g0008(NbOTU1)。研究结果证明这两个蛋白的确是有别于先前报道的家蚕微孢子虫孢壁蛋白的新成员。主要研究结果如下:
　　一、具有串联重复序列特征的蛋白NbHSWP16的研究
　　1家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析
　　1.1家蚕微孢子虫串联重复蛋白的筛选及特征分析
　　通过对这两种算法获得的检索结果进行比较，最终获得396个候选蛋白，候选蛋白中串联重复序列所在的位置和它们的氨基酸组成的分析结果表明:在家蚕微孢子虫中，串联重复序列在其所在蛋白中的位置分布是随机的，不具有位置偏好性;在氨基酸组成方面，它们倾向于利用极性的氨基酸来组建其序列，而对疏水性的氨基酸则相对比较排斥。编码串联重复序列的核酸序列GC含量与家蚕微孢子虫基因组的GC含量的比较分析表明:串联重复序列所对应核酸序列的GC含量要高于家蚕微孢子虫基因组的GC含量。对获得的396个候选蛋白基因的功能进行GO分类分析，发现这些蛋白主要涉及的功能有细胞构成、分子结合、细胞催化过程、细胞过程和代谢过程等，另外，还发现一些蛋白可能与蛋白定位和信号应激有关。
　　1.2家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析
　　从NCBI数据库下载其他9种微孢子虫的基因组编码蛋白信息，将这9种微孢子虫中串联重复蛋白的序列特征与家蚕微孢子虫进行比较基因组学分析，结果表明:感染昆虫的微孢子虫以及感染线虫的微孢子虫中串联重复蛋白的数目要大于感染哺乳动物的微孢子虫中的数目。串联重复序列氨基酸组成情况的比较分析表明:除A.locustae外，其余8种微孢子虫串联重复序列的氨基酸组成情况基本与家蚕微孢子虫中的组成情况相一致，即他们都倾向于利用亲水性的氨基酸来组建其串联重复序列，而对疏水性的氨基酸则相对比较排斥。GC含量的比较分析表明:在所选择的其他9种微孢子虫中，除比氏肠道微孢子虫E.bieneusi外，其他8种微孢子虫串联重复序列对应核酸序列的GC含量均高于其基因组的GC含量。这一结果说明，大多数微孢子虫串联重复蛋白具有选择高GC含量的密码子对其序列进行编码的偏好性。
　　1.3家蚕微孢子虫潜在孢壁蛋白的预测及部分蛋白编码基因的转录谱分析
　　对家蚕微孢子虫中获得的396个蛋白进行筛选分析。结果共获得86个家蚕微孢子虫的潜在孢壁蛋白，其中含有信号肽的蛋白有37个，含有跨膜结构域的蛋白有45个，同时含有信号肽和跨膜结构域的蛋白有4个。在添食家蚕微孢子虫3天后，编码NBO_24g0018和NBO_29g0021(NbHSWP16)蛋白的基因开始表达;在添食家蚕微孢子虫4天后，编码NBO_490g0001蛋白的基因开始表达;在添食家蚕微孢子虫5天后，编码NBO_378g0015蛋白的基因开始表达。
　　2家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的鉴定及功能分析
　　2.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbHSWP16的序列特征分析
　　采用生物信息学的方法对NbHSWP16进行序列特征分析，结果发现编码该蛋白的基因由1152个核苷酸组成，编码383个氨基酸。NbHSWP16的预测分子量为44.0kDa，等电点为8.95。磷酸化位点和糖基化位点预测发现，该蛋白序列中含有30多个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点。同时，还发现NbHSWP16含有29个半胱氨酸残基(7.6％)，推测其可能会通过形成二硫键的方式来稳定蛋白质的结构。该蛋白在N末端具有一个由25个氨基酸组成的信号肽序列，但没有GPI锚定位点和跨膜结构域。
　　2.2家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbHSWP16的鉴定
　　免疫印迹结果表明NbHSWP16的鼠多克隆抗体可以与家蚕微孢子虫总蛋白发生免疫反应。NbHSWP16的鼠多克隆抗体可以在孢子总蛋白中杂交到一条特异的与假定孢壁蛋白NbHSWP16预测理论分子量大小一致的杂交条带，但是含量却相对较低，这说明NbHSWP16在成熟家蚕微孢子虫中有表达，暗示该蛋白可能在家蚕微孢子虫中发挥功能。
　　间接免疫荧光实验结果表明NbHSWP16可以被定位在成熟家蚕微孢子虫的孢壁上，并且在获得的成熟孢子的孢壳上也可以获得较强的定位信号。NbHSWP16在成熟家蚕微孢子虫中主要定位于孢子外壁，这说明NbHSWP16是一个孢子外壁蛋白，因此将其更名为NbSWP16。在孢子孢壁开始形成的早期阶段，该蛋白已经开始表达，并且随着孢子的发育，该蛋白的表达量有逐渐增加的趋势。这一结果与第三章中Nbswp16基因在RNA水平上的转录分析结果相一致，推测该蛋白可能参与家蚕微孢子虫孢壁的组装过程。
　　2.3家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的功能分析
　　2.3.1家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16在细胞黏附过程中的作用分析
　　利用抗体封闭实验在细胞水平上对NbSWP16蛋白在孢子黏附宿主细胞过程中的功能进行研究。结果说明NbSWP16蛋白可能参与孢子对宿主细胞的黏附过程。两个抗体在抑制家蚕微孢子虫对宿主细胞的黏附过程中可能不存在叠加效应。
　　2.3.2家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16中重复序列与其蛋白功能的相关性分析利用酵母定位系统和应激性实验对NbSWP16蛋白中存在的重复序列的功能进行研究。酵母定位结果表明缺失NbSWP16蛋白重复序列的突变体酵母中的定位情况与pUG35-Nbswp16菌株中的定位情况相比不存在差异，这表明NbSWP16蛋白中的重复序列可能与其在细胞内的定位情况无关。酵母应激性实验结果表明，和对照相比，表达NbSWP16蛋白及其突变体的酵母在面对由变性剂0.2％ SDS、5％β-巯基乙醇以及0.1M DTT创造的应激条件时，与对照相比，这三个菌株对这些应激条件均不敏感。由上述结果可知，NbSWP16蛋白具有一定的抵御外界碱性条件和热激条件的能力，并且NbSWP16蛋白序列中的重复序列可能与其具有抵御碱性条件的能力有关。
　　3.3.3家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的互作蛋白分析
　　利用酵母双杂交技术结合本实验室构建的孢壁蛋白文库对家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的互作蛋白进行分析。结果表明:NbSWP16蛋白可能与家蚕微孢子虫的孢壁蛋白NbSWP1、NbSWP3、NbSWP5以及NbHSWP6之间存在相互作用。这一结果为家蚕微孢子虫孢壁蛋白间互作关系的研究提供了新的线索。
　　二、具有otubain结构域的孢壁蛋白NbOTU1的研究
　　1家蚕微孢子虫侵染相关蛋白酶的检索分析
　　据文献报道，病原微生物的蛋白酶在其侵染和免疫逃避过程中发挥着重要作用，蛋白定位分析结果表明部分蛋白酶也被定位于病原微生物的表面。利用全基因组检索的办法，对家蚕微孢子虫中的侵染相关蛋白酶进行检索，结果发现家蚕微孢子虫中存在大量的金属蛋白酶;相对少量的丝氨酸蛋白酶以及半胱氨酸蛋白酶。然而没有检索到天冬氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的存在。其中，金属蛋白酶主要分为M1、M16、M17、M24和M485个家族，共有22个;丝氨酸蛋白酶为丝氨酸S8家族蛋白酶，共有3个;半胱氨酸蛋白酶为注释为具有otubain结构域的去泛素化蛋白酶，共有3个。有报道称，在病原微生物中，去泛素化蛋白酶可能与其逃避宿主的先天性免疫逃避过程相关，因此，为了阐述家蚕微孢子虫的去泛素化蛋白酶是否与该过程有关，以具有otubain结构域的NbOTU1为对象进行后续研究。
　　2家蚕微孢子虫NbOTU1的序列特征分析
　　同源序列比对和进化分析发现，该蛋白在微孢子虫中是比较保守的。另外，从同源序列比对和蛋白三维结构模拟结果中，还可以发现该类蛋白都含有otubains蛋白酶家族所特有的催化三联体结构位点，即天冬氨酸残基(D46)、半胱氨酸残基(C45)和组氨酸残基(H209)。值得注意的是，感染哺乳动物微孢子虫中的otubains蛋白的序列保守性要相对高于感染昆虫微孢子虫的otubains，这说明在不同的微孢子虫属中该类蛋白还存在一定的差异性。
　　3家蚕微孢子虫NbOTU1的鉴定及功能分析
　　NbOTU1蛋白是家蚕微孢子虫孢壁蛋白中的一个新成员，并且其具有去泛素化酶的活性。据目前已有的文献报道可知，NbOTU1是微孢子虫中第一个被鉴定的具有去泛索化功能的蛋白酶。
　　综上所述，本文完成家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析，并对家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16进行鉴定和功能分析;随后，也将家蚕微孢子虫的去泛素化蛋白酶NbOTU1成功鉴定为另一个新的孢壁蛋白。本研究不仅丰富了家蚕微孢子虫的孢壁蛋白组成，而且也为阐明微孢子虫孢壁的形成机制研究提供了新的线索和支撑。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 微孢子虫概述

1．1．1 微孢子虫生物学特征

1．1．2 微孢子虫的基因组研究进展

1．1．3 微孢子虫的侵染方式研究进展

1．1．4 微孢子虫孢壁相关蛋白的研究进展

1．2 串联重复蛋白研究进展

1．2．1 串联重复蛋白筛选算法的研究进展

1．2．2 串联重复蛋白的功能研究进展

1．3 具有otubian结构域蛋白的研究进展

第二章 引言

2．1 研究背景

2．2 研究目的及意义

2．3 主要研究内容

2．3．1 家蚕微孢子虫具有串联重复序列特征的孢壁蛋白NbHSWPl6的研究

2．3．2家蚕微孢子虫具有otubains结构域的孢壁蛋白NbOTU1的研究

2．4 研究技术路线

第三章 家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 家蚕微孢子虫串联重复蛋白的特征分析

3．2．2 家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析

3．2．3 家蚕微孢子虫潜在孢壁蛋白的预测分析

3．2．4 家蚕微孢子虫4个串联重复蛋白编码基因的转录分析

3．3 结论与讨论

第四章 家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbSWP16的鉴定及功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 基因组数据

4．1．2 实验材料

4．1．3 序列分析软件与在线网址

4．1．4 仪器与实验试剂

4．1．5 主要方法

4．2 结果与分析

4．2．1 NbHSWP16蛋白的序列特征分析

4．2．2 NbHSWP16蛋白的表达及抗体制备

4．2．3 NbHSWP16蛋白在家蚕微孢子虫中的定位分析

4．2．4 NbSWP16蛋白的功能分析

4．3 结论与讨论

第五章 家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbOTU1的鉴定及功能分析

5．1 材料与方法

5．1．1 基因组数据

5．1．2 实验材料

5．1．3 序列分析软件与在线网址

5．1．4 仪器与实验试剂

5．1．5 主要实验方法

5．2 果与分析

5．2．1 家蚕微孢子虫侵染相关蛋白酶的检索分析

5．2．2 家蚕微孢子虫去泛素化蛋白酶的序列特征分析

5．2．3 家蚕微孢子虫编码NbOTU1蛋白基因的表达谱分析

5．2．4 家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbOTU1的鉴定及功能分析

5．3 结论与讨论

第六章 综合与结论

6．1 家蚕微孢子虫串联重复蛋白的比较基因组学分析

6．2 家蚕微孢子虫潜在孢壁蛋白NbHSWP16的鉴定及功能分析

6．3 家蚕微孢子虫孢壁蛋白NbOTU1的鉴定及功能分析

论文创新点

参考文献

在读期间发表文章及参研课题

附录

致谢