C2C12细胞成肌分化基因芯片统合分析及Lrrc75b对成肌分化的作用

摘要

[目的]：
　　1.对C2C12细胞成肌分化芯片进行统合分析，筛选出C2C12细胞成肌分化一致性差异表达基因集，并采用生物信息学软件分析成肌分化相关基因本体和信号转导通路。
　　2.探讨差异表达基因Lrrc75b对C2C12细胞成肌分化的影响及作用机制。
　　[方法]：
　　1.采用dChip软件对GEO数据库中C2C12成肌分化芯片GSE4694、GSE5447、GSE5305进行分析。采用GATHER软件对一致性上调（或下调）基因集进行基因本体、KEGG Pathway富集分析。
　　2.用2％马血清对C2C12细胞进行成肌分化诱导，显微镜下观察成肌分化0d，1d，3d，5d的细胞形态变化及肌管形成;收集成肌分化0d，1d，3d，5d蛋白质，Western印迹实验检测成肌标志蛋白myogenin，MyHC的表达情况。
　　3.用2％马血清对C2C12细胞进行成肌分化诱导，提取成肌分化0d，1d，3d，5d细胞RNA，qRT-PCR检测Lrrc75b在成肌分化过程的时序表达模式。
　　4.Lrrc75b stealth RNAi转染C2C12细胞，进行成肌分化诱导，于第3d进行免疫荧光染色，观察肌管形成情况;Western印迹实验检测成肌分化0h，12h，24 h，48 h，72 h myogenin，MyHC蛋白表达情况及成肌分化0h，24 h，48h，72 h ERK1/2蛋白的表达变化。
　　5.Lrrc75b重组腺病毒感染C2C12细胞，进行成肌分化诱导，于第5d进行免疫荧光染色，观察肌管形成情况;Western印迹实验检测成肌分化0d，1d，3d，5 d myogenin，MyHC蛋白表达情况及ERK1/2蛋白的表达变化。
　　[结果]：
　　1.通过对C2C12成肌分化基因芯片进行分析，筛选出GSE4694中上调表达基因1497个，下调表达基因1539个;GSE5447中上调表达基因2378个，下调表达基因2439个;GSE5305中上调表达基因1177个，下调表达基因2101个。对上述结果进行统合分析，在2个及以上实验数据中均出现差异表达的一致性上调表达基因集932个，一致性下调表达基因集1198个。GATHER软件分析表明:一致性上调表达基因集中富集GO:0006936(muscle contraction)，GO:0007517(muscle development)等基因本体;mmu04910(Insulin signalling pathway)，mmu04020(Calcium signalling pathway), mmu04010(MAPK signaling pathway)等信号通路。而一致性下调表达基因集中主要富集GO:0007049(cell cycle)，GO:0008283(cell proliferation)等基因本体;mmu00240(Pyrimidine metabolism)，mmu00230(Purine metabolism)等代谢相关信号通路。
　　2.C2C12细胞形态呈梭形，均一;当细胞处于成肌分化诱导液培养，2d后细胞开始融合，出现两个核以上的肌管，随着成肌诱导时间的延长，肌管数量逐渐增加，肌细胞逐渐融合，肌管逐渐变大变长。Western印迹实验结果显示成肌分化过程成肌分化标志蛋白myogenin，MyHC表达逐渐增加。
　　3.基因芯片分析结果提示Lrrc75b在成肌分化中表达下调。在C2C12成肌分化模型，qRT-PCR结果进一步证明，成肌分化过程Lrrc75b mRNA表达水平逐渐降低。
　　4.免疫荧光染色结果显示，与si-Control组比较，si-Lrrc75b组肌管面积、肌管融合指数明显增加，两组差异具有统计学意义(P＜0.05);与Ad-GFP组比较，过表达Ad-Lrrc75b组肌管面积、肌管融合指数明显减少，两组差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　5.与si-Control组比较，sj-Lrrc75b组成肌标志蛋白myogenin，MyHC的表达量明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05);与Ad-GFP组比较，过表达Ad-Lrrc75b组myogenin蛋白表达量明显减少，两组差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　6.与si-Control组比较，si-Lrrc75b组抑制ERK1/2磷酸化水平;与Ad-GFP组比较，过表达Ad-Lrrc75b组上调ERK1/2磷酸化水平。
　　[结论]：
　　1.成肌分化芯片Meta分析结果显示，一致性上调表达基因集932个，一致性下调表达基因集1198个，其中Lrrc75b是一致性下调表达基因。
　　2.在C2C12细胞成肌分化模型，伴随成肌分化的发生，Lrrc75b mRNA表达水平逐渐降低，与基因芯片Meta分析结果相符合。
　　3.在C2C12成肌分化过程，通过RNAi方法特异性降低Lrrc75b基因表达，肌管面积、肌管融合指数明显增加;myogenin，MyHC蛋白表达量明显增加。结果表明下调Lrrc75b表达，促进C2C12细胞成肌分化。
　　4.通过重组腺病毒高表达外源性Lrrc75b基因，C2C12细胞成肌分化能力下降，肌管面积、肌管融合指数明显减少，myogenin蛋白表达量明显减少。结果表明过表达Lrrc75b，抑制C2C12细胞成肌分化。
　　5.与si-Control组比较，si-Lrrc75b组抑制ERK1/2磷酸化水平;与Ad-GFP组比较，过表达Ad-Lrrc75b组上调ERK1/2磷酸化水平。提示Lrrc75b对成肌分化的调节作用可能通过ERK1/2通路实现。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 C2C12细胞成肌分化基因芯片统合分析

2．1 研究目的

2．2 实验材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

3 成肌分化过程Lrrc75b的动态变化及对成肌分化的影响

3．1 研究目的

3．2 实验材料

3．3 实验方法

3．4 结果

3．5 讨论

4 Lrrc75b对ERK信号通路的影响

4．1 研究目的

4．2 实验材料

4．3 实验方法

4．4 结果

4．5 讨论

5 小结

参考文献

综述 长链非编码RNA在成肌分化中的作用

致谢

附录一：缩写词中英文对照

附录二：在读期间的科研情况