EPO与“肾精”相似性的体内验证及“补肾益精”中药健脑作用机制研究

摘要

背景：补肾益精中药治疗脑部疾病是一个有效的方法，对于老龄化社会有独特的价值和难以取代的优势。但是“肾精”具体是什么物质，它又是如何发挥脑保护作用，目前还不清楚。课题组前期研究发现，EPO有类似于肾精的作用，故提出EPO可能为“肾精”之一。前期研究发现肾虚大鼠脑内EPO的表达量显著下调，同时补肾药右归饮逆转肾虚大鼠脑内EPO表达量下调的作用，但在衰老模型上尚未进行验证。本项研究受国家自然科学基金面上项目（81473549）、教育部博士点基金博导类（20110182110012）、重庆市卫生局中医药科技重大项目（渝中医2010-1-4）资助。
　　目的：验证EPO与“肾精”的来源及作用的相似性，阐明“肾精”的生物学物质基础和“肾精通于脑”的生物学作用机制，为“补肾益精健脑”中药的研发和筛选提供新的思路和方法。
　　方法：
　　1．衰老模型大鼠的建立与相关组织中EPO的表达变化
　　自然衰老大鼠模型的验证与相关组织中EPO的表达变化将SD大鼠分为2组，青年组（2月龄，n=13）和自然衰老组（24月龄，n=13），观察大鼠体重、皮毛的光洁程度，以旷场试验检测大鼠的水平活动度，测试盒检测脑内β-半乳糖苷酶、血清中SOD、MDA。Western Blot检测衰老大鼠脑、肾、骨髓中EPO/EPOR的表达，ELISA检测衰老大鼠外周血血清和骨髓上清中EPO的表达。
　　D-半乳糖衰老大鼠模型的建立以及脑组织中 EPO的表达变化取2月龄的SD雄性大鼠52只，体质量为200±20g，按随机数字表随机法分成空白对照组、50mg/kg、150mg/kg、250mg/kg D-半乳糖衰老组，每组13只。D-半乳糖衰老组依次皮下注射相应浓度的等体积的D-半乳糖，空白对照组则皮下注射等体积的生理盐水，连续给药八周，记录大鼠体重、皮毛的光洁程度变化。水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力，其他检测方法同上。
　　2.补肾药的抗衰老作用及其对EPO表达变化的影响
　　补肾药对自然衰老大鼠的抗衰老作用及其对EPO表达变化的影响取24月龄的SD雄性大鼠52只，体质量500±50g，按随机数字表法分成自然衰老模型组、右归饮水提物（10g/kg）组、熟地黄水提物（4g/kg）组、制首乌水提物（2g/kg）组，每组13只，连续给药4周，2月龄的SD雄性大鼠作为青年对照。记录大鼠体重、皮毛的光泽程度。旷场实验检测大鼠的水平活动度，测试盒检测大鼠脑中β-半乳糖苷酶、SOD和MDA。Western Blot检测大鼠脑、肾、骨髓中EPO/EPOR的表达，ELISA检测衰老大鼠外周血血清和骨髓上清中EPO的表达。
　　补肾药对D-半乳糖衰老大鼠的抗衰老作用及其对EPO表达变化的影响取2月龄的雄性SD大鼠39只，体质量200±20g，分空白对照组、150mg/kg D-半乳糖衰老组、熟地黄组，每组13只，D-半乳糖衰老组和熟地黄组颈背部皮下注射150mg/kg D-半乳糖，空白对照给予等体积的生理盐水，连续8周，熟地黄组从第5周开始，灌胃熟地黄水提物（4g/kg），连续给药4周，其他组灌胃等体积的蒸馏水，检测指标方法同上。
　　3.补肾药“EPO样”抗脑衰老作用及其分子作用机制研究
　　补肾药“EPO样”抗脑衰老作用取自然衰老大鼠实验中相关的大鼠组织，测试盒检测大鼠脑内海马区SOD活性和MDA的含量，TUNEL检测脑细胞的凋亡状态，Western blot检测大鼠海马区caspase3的表达，采用VEGFR2和CD133双标流式细胞术法检测骨髓中内皮祖细胞的数量变化，采用VIII因子免疫荧光标记脑组织中内皮祖细胞，Wester Blot检测脑组织中VEGFR2表达，观察补肾药类似EPO的抗氧化、抗凋亡、促脑血管新生作用。
　　补肾药脑保护的分子机制研究取自然衰老大鼠的脑组织蛋白，Wester Blot检测脑组织中HIF-2α、p-AKT和p-STAT5的表达变化，分析补肾药的脑保护作用的分子信号通路。
　　结果：
　　1.衰老模型大鼠的建立以及衰老大鼠相关组织中EPO表达的下调
　　自然衰老大鼠模型的建立以及诱导其相关组织中EPO的表达下调与青年鼠相比，自然衰老大鼠皮毛粗糙发黄，自主活动度显著下降（P<0.05），脑内衰老标记物β-半乳糖苷酶显著增多，血清中SOD活性显著减弱，MDA含量显著增多（均P<0.01），提示自然衰老大鼠模型成功。与青年鼠相比，自然衰老大鼠肾脏、骨髓细胞、脑内 EPO、EPOR的表达均显著降低，外周血血清、骨髓上清液中分泌的EPO也有显著降低（均P<0.05），提示衰老的同时，伴随着肾脏、脑、骨髓以及外周血EPO的降低。
　　D-半乳糖衰老大鼠模型的建立以及诱导脑组织中 EPO的表达下调与空白对照组相比，150mg/kg和250mg/kgD-半乳糖组大鼠皮毛发黄，水迷宫中潜伏期均显著延长，穿越平台原位置次数显著减少，同时脑内衰老标记物β-半乳糖苷酶含量显著增多，血清中SOD活性显著减弱，MDA含量显著增多（均P<0.05），显示造模成功。与空白对照组组比较，150mg/kg、250mg/kg D-半乳糖模型组脑内EPO、EPOR的表达均显著降低（P<0.05），提示D-半乳糖致亚急性衰老大鼠伴随脑内EPO的降低。
　　2.补肾药的抗衰老作用以及对大鼠相关组织中EPO含量的影响
　　补肾药对自然衰老大鼠抗衰老作用及其对相关组织中EPO含量的影响与自然衰老大鼠相比，右归饮组、熟地黄组、制首乌组大鼠脑内β-半乳糖苷酶与，血清中SOD活性显著增强，MDA含量显著减少（均P<0.05），提示右归饮、熟地黄、制首乌有抗氧化衰老作用。①与自然衰老大鼠相比，右归饮、熟地黄、制首乌组可显著增加脑内海马区 EPO/EPOR的表达，降低肾脏组织中 EPO的表达（均P<0.05），但对肾脏和骨髓细胞中的EPOR的表达变化无统计学意义（P>0.05），提示补肾药可促进海马区、肾脏中EPO表达。②与自然衰老大鼠相比，右归饮、熟地黄可显著性增加骨髓上清液和外周血清中EPO的表达（P<0.05），但制首乌对其表达变化无统计学意义（P>0.05），提示右归饮、熟地黄促进衰老大鼠骨髓和外周血中EPO的分泌。
　　熟地黄水提物对D-半乳糖衰老大鼠的抗衰老作用及其对海马区EPO表达量的影响①与D-半乳糖衰老大鼠相比，熟地黄水提物组大鼠逃避潜伏期显著缩短，穿越原平台位置次数显著增多，脑内β-半乳糖苷酶含量与血清中MDA含量显著减少，血清中SOD活性显著增强（均P<0.05），提示熟地黄水提物抗衰老作用。②与D-半乳糖衰老大鼠相比，熟地黄水提物组脑内EPO、EPOR的表达显著增加（P<0.05），提示熟地黄水提物可促进D-半乳糖衰老大鼠脑内EPO、EPOR表达。
　　3.补肾药的“EPO样”脑保护作用及其机制研究
　　补肾药“EPO样”脑保护作用与自然衰老组相比，补肾药右归饮、熟地黄、制首乌组脑组织中 SOD活性显著增强，MDA含量显著减少，脑细胞凋亡数目显著减少，海马区Caspase3表达显著降低，同时股骨骨髓中内皮祖细胞的数量显著增多，脑组织海马区内皮细胞的数量显著增多，VEGFR2表达显著增多（均P<0.05），提示补肾药右归饮、熟地黄、制首乌均有类似EPO的抗氧化、抗脑凋亡以及促脑血管新生的作用。
　　补肾药脑保护作用分子机制研究与自然衰老大鼠相比，补肾药右归饮、熟地黄、制首乌组EPO上游调控因子 HIF-2α的表达均显著增多，EPO下游蛋白p-STAT5表达也显著增加（均P<0.05），而p-AKT变化无统计学意义（P>0.05），提示补肾药有上调脑内HIF-2α表达调控 EPO的生成以及通过增加EPO下游的STAT5表达发挥脑保护作用。
　　结论：EPO与衰老有着密切的关系，与“肾精”的变化以及肾精的功能有很大的相似性，体内验证了EPO可能为“肾精”的物质基础之一。同时补肾中药右归饮、熟地黄、制首乌有延缓衰老以及增加脑内EPO、EPOR表达并发挥“EPO样”的脑保护作用，其机制与其增加上游的HIF-2以及下游的STAT5的表达有关。

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前言

第一章 衰老大鼠模型的建立以及衰老与EPO表达的关系研究

第一节 自然衰老大鼠模型的验证及其相关组织中EPO的表达变化

第二节 D-半乳糖致衰老大鼠模型的建立以及脑组织中EPO的表达变化

讨论

本章小结

参考文献

第二章 补肾药的抗衰老作用及其对EPO表达变化的影响

第一节 补肾药对自然衰老大鼠模型的抗衰老作用及其对EPO表达变化的影响

第二节 补肾药对D-半乳糖衰老大鼠模型的抗衰老作用及其对脑内

讨论

本章小结

参考文献

第三章 补肾益精中药“EPO样”脑保护作用及其分子机制研究

第一节 补肾药的“EPO样”脑保护作用

第二节 补肾药“EPO样”脑保护作用机制研究

讨论

本章小结

参考文献

全文总结

创新点及意义

思考与展望

文献综述:促EPO生成抗脑缺血中药的研究

致谢

硕士期间工作汇报

英汉缩略语名词对照

附图