梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其机制研究

摘要

背景：梓葛冻干粉针为本团队自主研发的中药单体复方注射剂，其主要药效成分为梓醇和葛根素，拟用于缺血性卒中的治疗。本团队在前期的体内、外试验中发现梓葛冻干粉针对缺血性卒中损伤模型具有保护作用，但其分子机制尚不清楚。本课题观察了梓葛冻干粉针对体外星形胶质细胞缺氧/复氧损伤模型的保护作用，并阐明了其分子作用机制。本课题获得了国家自然科学基金（面上项目81473549，青年项目31402237）、教育部博士学科点专项基金（博导类：20110182110012）、重庆市卫生局中医药科研重大项目（渝中医2010[60]2010-1-4）、重庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2014jcyjA80023）、教育部中央高校基本科研业务费（XDJK2014C058）的支持。
　　目的：观察梓葛冻干粉针对原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用，并阐明其发挥的保护作用的机制。为梓葛冻干粉针的新药创制提供基础实验依据。
　　方法：
　　1.SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的原代分离培养与鉴定无菌分离新生2-3d的SD大鼠乳鼠大脑皮层，经消化过滤后，于含10％FBS的DMEM-F12培养基中进行星形胶质细胞的培养。待细胞长至融合时，以220rpm的速度于摇床上旋转振荡18h对细胞进行纯化。利用FITC-GFAP并结合DAPI对星形胶质细胞进行免疫荧光鉴定，细胞纯度用Image-Pro Plus6.0进行分析。
　　2.星形胶质细胞缺氧/复氧损伤模型的建立及梓葛冻干粉针的保护作用试验分为正常组、模型组、辅料组（β-环糊精）以及梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组。每组设6个复孔。星形胶质细胞缺氧/复氧损伤模型的建立参照实验室前期实验方法，选择缺氧6h，复氧12h作为损伤条件。辅料组和药物组分别在缺氧和复氧开始时给药一次。利用倒置显微镜观察细胞损伤前后的形态变化；同时，在复氧结束时后，采用MTT法测定各组细胞的存活率，测定LDH漏出率以评价细胞膜的损伤程度；采用TUNEL荧光染色法细胞凋亡率；并利用Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3和PRAP-1等蛋白在细胞中的表达水平。
　　3.梓葛冻干粉针对缺氧/复氧损伤星形胶质细胞炎症反应的抑制作用及其机制研究复氧结束后，采用硝酸还原酶法测定各组细胞培养液中NO的释放量；ELISA法检测TNF-α、IL-1β及PGE2在细胞培养液中的释放量；Western blot法检测细胞中iNOS、COX-2、NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκB-α，p-IκB-α及p-IKKα/β等蛋白的表达量。
　　4.梓葛冻干粉针对缺氧/复氧损伤星形胶质细胞氧化应激反应的抑制作用及其机制研究复氧结束后，分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸显色法及二硫代二硝基苯甲酸显色法检测各组细胞中SOD、MDA和GSH的含量；荧光酶标仪检测细胞中DCFH-DA探针的荧光强度，以反映细胞中ROS的生成量；并利用Western bolt法检测Nrf-2和HO-1蛋白在细胞中的表达水平。
　　结果：
　　1.成功分离培养出原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞星形胶质细胞在接种24h内完成贴壁，2d后细胞逐渐增殖，并在第3-4d增殖速度最快，第5d时细胞数量进一步增加，到第6d时细胞已基本铺满整个培养瓶底部。细胞摇瓶纯化后，经GFAP-FITC结合DAPI免疫荧光鉴定为星形胶质细胞，其纯度达97%以上。
　　2.梓葛冻干粉针对缺氧/复氧损伤星形胶质细胞具有保护作用与正常组相比，模型组细胞存活率显著降低，LDH漏出率显著增高（均P<0.01），细胞胞体剧烈收缩，部分细胞脱落，数量降低，光泽度降低；同时，模型组细胞凋亡率及Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平均显著升高，PARP-1含量显著降低（均P<0.01）。与模型组相比，梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞存活率均显著升高（均P<0.05），LDH漏出率均显著降低（均P<0.05），细胞的形态有所著改善，细胞胞体较舒展，密度增加，光泽度有所恢复；同时，细胞凋亡率及 Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量均显著降低，PARP-1含量显著升高（均P<0.05）。
　　3.梓葛冻干粉针可有效抑制缺氧/复氧损伤星形胶质细胞中炎.症反应的发生与正常组相比，模型组细胞培养液中TNF-α、IL-1β、NO和PGE2的释放量及细胞iNOS和COX-2蛋白表达量均显著升高（均P<0.01）。与模型组相比，梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.5μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞培养液中IL-1β、NO和PGE2释放量以及细胞iNOS蛋白表达水平均显著降低（均P<0.05）；并且梓葛冻干粉针24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞培养液中TNF-α释放量和细胞中COX-2蛋白的表达水平也显著降低（均P<0.05）。
　　与正常组相比，模型组细胞IKKα/β、IκB-α和NF-κB p65等蛋白的磷酸化水平均显著升高（均P<0.01）。与模型组相比，梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1组细胞中NF-κB p65蛋白的磷酸化水平均显著降低（均P<0.05）。并且梓葛冻干粉针24.50μg·mL-1和49.00μg·mL-1组细胞中 IKKα/β和IκB-α蛋白的磷酸化水平也显著降低（均P<0.05）。
　　4.梓葛冻干粉针可显著抑制缺氧/复氧引起的星形胶质细胞氧化应激损伤与正常组相比，模型组细胞中ROS和MDA含量显著升高，同时SOD活性和GSH含量均显著降低（均 P<0.01）。与模型组相比，梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞中MDA和ROS含量显著降低，GSH含量显著升高（均P<0.05）；并且梓葛冻干粉针24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞中SOD活性也显著升高（均P<0.05）。
　　与正常组相比，模型组细胞中Nrf-2和HO-1蛋白的表达水平均出现显著升高（均P<0.05）。与模型组相比，梓葛冻干粉针12.25μg·mL-1组、24.50μg·mL-1组和49.00μg·mL-1组细胞中Nrf-2和HO-1蛋白的表达水平均出现进一步升高，并具有显著性差异（均P<0.05）。
　　结论：
　　1.成功分离培养出原代的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞，其纯度达97%以上，符合试验要求。
　　2.梓葛冻干粉针对星形胶质细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用，能够显著改善细胞的形态学特征，提高损伤细胞的存活率，降低LDH漏出率，并抑制细胞凋亡。
　　3.梓葛冻干粉针可有效抑制缺氧/复氧损伤星形胶质细胞炎症反应的发生，能够抑制NF-κB信号通路的激活，显著降低细胞中炎症因子的释放量。
　　4.梓葛冻干粉针可显著抑制缺氧/复氧引起的星形胶质细胞氧化应激损伤，能够有效抑制氧自由基的产生并促进抗氧化蛋白的生成，其机制可能与药物能进一步激活Nrf-2/HO-1信号通路有关。

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中文摘要

英文摘要

前言

第一章 梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

第一节 SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的分离、培养与鉴定

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 结论

第二节 梓葛冻干粉针对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

1 试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 结论

第二章 梓葛冻干粉针对缺氧/复氧损伤星形胶质细胞保护作用的机制研究

第一节 梓葛冻干粉针对缺氧复氧损伤星形胶质细胞的抗炎作用研究

1试验材料

2 试验方法

3 试验结果

4 结论

第二节 梓葛冻干粉针对缺氧复氧损伤星形胶质细胞的抗氧化作用研究

1试验材料

2 试验方法

3试验结果

4 结论

讨论

全文总结

创新点及意义

思考与展望

参考文献

综述:卒中发生的病理过程及星形胶质细胞在其中的作用

致谢

硕士学位期间科研工作汇报

附：英汉缩略语名词对照表

实验附图