基于目标循环放大及背景抑制策略构建灵敏的DNA荧光生物传感器的研究

摘要

生物传感器是由分析化学、生物化学、生物医学和生物技术等领域相互渗透而形成的一个新兴的研究课题。生物传感器凭借其设备简单、易于携带、测试成本低廉、检测快速方便、结果灵敏可靠以及易于实现原位活体检测等优势，跻身当前的研究热点之一。DNA荧光传感器便是其中一种。DNA荧光生物传感器通过DNA生物传感器将目标物的信号转换成荧光信号进行输出和检测，进而对目标物进行定性及定量分析。这种分析方法将生物传感器的特异性、易于实现多种放大策略的优点和荧光传感器的高灵敏度、高选择性和较高的仪器普及率等特点结合起来，大大提高了分析测试的灵敏度、准确度和可操作性。这些特点使得DNA荧光生物传感器吸引了大量研究者的目光，因而该技术也得到了不断的发展。
　　然而随着基因测序、疾病诊断、食品药品监控、环境保护等领域对于分析检测技术的要求不断提高，DNA荧光传感器的研究也迫切需要更加深入，以期发展出更加灵敏快速、准确可靠、简易、实惠的测定方法，服务科研和社会。本文以DNA荧光传感技术为基础结合多种酶利用目标循环放大策略来提高方法的灵敏度，同时采用核酸外切酶Ⅲ和氧化石墨烯（GO）以实现对荧光背景信号的降低，构建了三种生物传感器分别用于灵敏地检测人p53原癌基因、凝血酶和L-组氨酸。
　　本文的主要研究内容如下：
　　基于toehold介导的目标循环放大反应和外切酶Ⅲ辅助的荧光背景信号降低方法构建的一种p53癌变基因片段检测传感器。设计一对带有黏性末端的发卡DNA用以识别人p53原癌基因，并被该目标基因片段特异性地打开，进而通过链置换反应的循环生产出大量的双链DNA，未反应的DNA加入外切酶Ⅲ进行水解。最后向体系中加入赛博绿Ⅰ荧光染料实现对双链DNA循环产物的专属性传感，通过荧光法检测目标基因片段的含量。该方法检测人p53原癌基因的检测限为5.34pM，且具有比较好的选择性和重复性。
　　通过凝血酶适配体与凝血酶的特异性识别与优先结合作用引发toehold介导的目标循环放大反应，并利用外切酶Ⅲ的水解作用，构建检测凝血酶的高特异性、高灵敏度的新方法。凝血酶适配体与凝血酶的竞争性结合后，释放出信息DNA片段，该信息DNA片段可以打开设计好的一对带黏性末端的发卡DNA，该DNA片段在发卡DNA间的不断循环，诱导形成大量双链DNA，最后引入外切酶Ⅲ将未反应的发卡DNA水解，加入赛博绿Ⅰ荧光染料后，染料分子与反应生成的双链DNA相互作用使得自身荧光大大增强，从而测定凝血酶的含量。该方法检测凝血酶的检测限为0.42pM，且具有比较好的选择性。
　　利用组氨酸作为辅因子使得核酸酶8-17DNAzyme独特的剪切活性被激活并引发一系列DNA聚合及循环放大过程，同时利用氧化石墨烯对DNA探针和产物双链的不同吸附作用及对荧光染料的猝灭作用降低背景信号，实现对组氨酸的灵敏检测。组氨酸激活核酸酶8-17DNAzyme的切割活性，释放出一段DNA片段，该片段可以触发一个循环聚合反应，产生大量的双链DNA；而剩下的DN A酶残基可以作为模板链，与体系中加入的另一引物相结合，并在聚合酶的作用下发生聚合反应并释放组氨酸进入循环，同时该反应能产生大量双链DNA。然后向体系中加入氧化石墨烯片层，吸附带有单链的DNA反应物以及单链引物。最后加入赛博绿Ⅰ荧光染料，该染料与溶液中游离的双链DNA作用而产生荧光信号；嵌入被石墨烯吸附的DNA双链部分中的染料分子的荧光则被GO所猝灭，使得体系的背景信号降低，以此实现灵敏测定组氨酸含量的目的。本传感器对于L-组氨酸检测的灵敏度达到了1.73pM。同时，由于采用了能够特异性识别L-组氨酸并且进行高效剪切的HD3型8-17DNAzyme，提高了方法的选择性和可靠性。

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第 1 章 绪 论

1. 1 DN A生物传感器

1. 2 赛博绿Ⅰ荧光染料

1. 3 提高 DNA传感器灵敏度的方法

1. 4 本文的研究思路

第 2 章 基于 toehold 链置换反应驱动的目标循环放大以及外切酶 Ⅲ 辅助背景信号降低原理构建荧光传感器用于突变 DNA序列的检测

2. 1 前言

2. 2 实验部分

2. 3 结果与讨论

2. 4 结论

第 3 章 基于 toehold 链置换反应驱动的目标循环放大以及外切酶 Ⅲ 辅助背景信号降低原理构建荧光传感器用于凝血酶的检测

3. 1 前言

3. 2 实验部分

3. 3 结果与讨论

3. 4 结论

第 4 章 基于脱氧核酶和 Klenow Fragment, Exo- 聚合酶的双重信号循环放大和氧化石墨烯辅助的背景信号降低策略检测 L-组氨酸

4. 1 前言

4. 2 实验部分

4. 3 结果与讨论

4. 4 结论

参考文献

硕士期间发表的论文

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