组蛋白赖氨酸甲基化转移酶SETDB1及其下游因子对神经母细胞瘤增殖分化的影响及机制研究

摘要

神经母细胞瘤是儿童最常见的实体肿瘤之一，其恶性程度高、异质性高、易对化疗产生耐药性、易转移、易复发。但自行消退与体外诱导分化成熟的特点，使其成为研究肿瘤分化的较好的模型，阐释其增殖和分化的机制，能够为该肿瘤的治疗提供新策略。研究者发现异常的组蛋白甲基化修饰往往引起基因表达活性的改变，从而成为肿瘤发生的主要诱因之一。组蛋白甲基化转移酶SETDB1，主要催化H3K9me3甲基化，在多种类型的肿瘤细胞中高表达，包括非小细胞肺癌，小细胞肺癌，胶质瘤和前列腺癌等，下调其表达会抑制癌细胞的增殖分化以及侵袭转移能力。
　　本研究探究组蛋白赖氨酸甲基化转移酶 SETDB1对神经母细胞瘤细胞的增殖及分化的影响及其机制，揭示了SETDB1及其下游效应因子在母瘤增殖和分化过程中的重要作用，以期能为神经母细胞瘤的治疗提供新思路。以下是本论文主要发现：
　　1.SETDB1参与神经母细胞瘤细胞增殖及分化的调控
　　我们采用Western blot和荧光定量PCR技术检测到SETDB1蛋白在神经母细胞瘤细胞系中有普遍表达，接着利用慢病毒介导的shRNA干涉技术在细胞系BE(2)-C和SHEP1细胞系中对SETDB1的表达进行下调，CCK8实验检测结果显示SETDB1si细胞的生长受到明显抑制。软琼脂实验发现SETDB1si细胞的克隆形成能力明显下降。同时我们通过建立荷瘤鼠模型，发现SETDB1si细胞的体内成瘤能力降低。最后，我们通过Microarray分析，并采用荧光定量PCR技术，Western blot和细胞免疫荧光实验检测了BE(2)-C和SHEP1细胞系的分化情况，发现SETDB1si细胞向着胶质细胞发生分化。
　　2.SETDB1调控嘌呤代谢途径的关键酶基因PRPS1，而PRPS1也对神经母细胞瘤细胞增殖和成瘤有影响
　　我们对SETDB1si细胞进行了Microarray分析，发现下调SETDB1影响了细胞的嘌呤代谢相关途径。PRPS1是嘌呤代谢过程中的关键限速酶，我们利用Western blot和荧光定量PCR技术检测到在SETDB1si的细胞中，PRPS1的表达也受到了抑制。接着我们对SETDB1以及PRPS1的启动子进行了染色质免疫共沉淀实验，结果显示，SETDB1以及H3K9me3均与PRPS1下游启动子676-859bp区域有显著结合，表明SETDB1能够调控PRPS1基因的转录，我们推测SETDB1可能通过调控PRPS1的表达来进一步影响细胞增殖。我们通过分析神经母细胞瘤临床预后数据库，发现PRPS1高表达会显著降低神经母细胞瘤患者的生存率，且PRPS1的表达水平与肿瘤患者的患病年龄、死亡原因、复发情况以及N-MYC的表达量等相关。因此我们利用慢病毒介导的shRNA干涉技术在细胞系BE(2)-C和SHEP1细胞系中对PRPS1进行下调。首先我们利用Western blot和荧光定量PCR技术检测到PRPS1蛋白在神经母细胞瘤细胞系中有普遍表达，然后利用细胞增殖标记BrdU进行免疫荧光染色实验检测PRPS1si后细胞的增殖情况，发现BrdU阳性率明显降低，表明细胞的增殖受到抑制。CCK8实验检测结果显示PRPS1si后细胞的生长受到明显抑制。流式细胞仪分析PRPS1si的细胞周期，发现细胞周期阻滞于G1期。软琼脂实验发现PRPS1si细胞的克隆形成能力显著降低，细胞的自我更新和增殖活性受到明显抑制。最后我们通过建立荷瘤鼠模型，发现PRPS1si细胞的成瘤能力降低。上述结果与前述SETDB1的实验结果说明，SETDB1通过调控PRPS1表达进而影响神经母细胞瘤细胞的增殖和成瘤。
　　3.SETDB1调控神经母细胞瘤原癌基因N-MYC的表达
　　为了研究SETDB1引起神经母细胞瘤细胞分化的机制，我们分析神经母细胞瘤临床预后数据库，发现SETDB1的表达量在有N-MYC扩增的患者中显著高于没有N-MYC扩增的患者。N-MYC最先在神经母细胞瘤中被证实为原癌基因，它通过影响神经母细胞瘤自我更新和分化能力，对神经母细胞瘤的发生发展产生重要影响。我们通过Microarray分析结果发现，下调SETDB1，包含N-MYC在内的与神经母细胞瘤自我更新能力的相关基因表达下降，进一步通过荧光定量PCR以及Western blot证实，下调SETDB1显著的降低了N-MYC的表达，说明SETDB1的确影响N-MYC表达。然后我们在干涉掉SETDB1的SHEP1细胞中过表达N-MYC，通过MTT实验以及BrdU标记实验可以看出，SHEP1-SETDB1si-N-MYC细胞的增殖能力得到一定恢复。最后我们为了研究 SETDB1与 N-MYC的调控关系，进行了ChIP-qPCR实验，结果显示 SETDB1以及H3K9me3均直接与N-MYC启动子上游区域-2885~-2723bp片段直接结合，暗示SETDB1直接调控原癌基因N-MYC，从而影响神经母细胞瘤的增殖和分化。
　　综上所述，SETDB1对神经母细胞瘤细胞的增殖、分化以及自我更新能力都具有重要作用；SETDB1的下调也会显著抑制嘌呤代谢途径关键酶基因PRPS1的表达，ChIP-qPCR实验表明SETDB1能调控PRPS1的表达，因此我们推测SETDB1可能通过调控PRPS1来影响核苷酸代谢，进一步影响细胞增殖。而PRPS1在神经母细胞瘤细胞的增殖中也具有重要作用；SETDB1与原癌基因N-MYC关系密切，SETDB1的表达与N-MYC的表达有正相关性，SETDB1可能直接通过N-MYC参与调控细胞的增殖分化。本研究结果为神经母细胞瘤的临床治疗神经母细胞瘤提供新策略，也丰富了该疾病的理论研究基础。

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第一章 全文综述

1.1组蛋白修饰

1.2组蛋白甲基化转移酶概述

1.3 组蛋白赖氨酸甲基化转移酶SETDB1的研究进展

1.4其他几种常见组蛋白赖氨酸甲基化转移酶与肿瘤的发生发展

1.5 小结

第二章 引言

2.1研究背景及意义

2.2主要研究内容

2.3技术路线

第三章 SETDB1调控神经母细胞瘤细胞增殖及分化

3.1材料及试剂

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 SETDB1调控嘌呤代谢途径关键酶基因PRPS1的表达，PRPS1对神经母细胞瘤细胞增殖和成瘤有显著影响

4.1材料及试剂

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4讨论

第五章 SETDB1调控神经母细胞瘤原癌基因N-MYC的表达

5.1材料及试剂

5.2实验方法

5.3结果与分析

5.4讨论

第六章 结论与讨论

6.1敲低SETDB1引起神经母细胞瘤细胞的生长增殖受到抑制，并诱导细胞向胶质细胞分化

6.2 SETDB1调控PRPS1的表达，敲低PRPS1也能抑制神经母细胞瘤细胞的生长增殖

6.3 SETDB1调控神经母细胞瘤原癌基因N-MYC，可能通过它影响细胞增殖与分化

6.4 展望

参考文献

在读期间发表论文及参研课题情况

缩略词表

致谢