超量表达GhGS1基因提高棉花对低氮胁迫的耐受性

摘要

氮素作为植物体内不可缺少的化学元素之一，对众多生理生化反应有重大影响。它不仅是核酸、蛋白质、磷脂及酶、辅酶和辅基如NAD+，NADP+，FAD等物质的主要成分，还是一些维生素、植物激素及次生代谢中间产物的重要组成成分。除此之外，作为植物叶绿素的一个重要组成元素，氮素在很大程度上影响植物光合作用中光反应和暗反应诸多酶的活性。因此合理调控氮代谢相关基因将有利于作物生长发育。棉花是一种氮素敏感植物，在农业生产中，需要大量施用氮肥来保证棉花产量与品质。但是作为棉花生产大国，大量施用氮肥在农业生产环境方面给我国带来很多负面影响。如何解决棉花对氮肥需求大和减少环境污染这一突出矛盾，提高棉花氮素利用率是解决此矛盾的核心和关键。
　　谷氨酰胺合成酶（Glutamine Synthetase, GS）是植物体氮代谢途径中进行“GS-GOGAT”循环不可缺少的关键酶。它是首个将外界环境的无机氮转化为植物体内含氮有机物的酶。为了研究 GS基因在棉花生长过程中的作用，我们克隆了棉花谷氨酰胺合成酶基因GhGS1，并构建表达载体进行了棉花遗传转化，使之在棉花中超量表达，从而探究GhGS1基因对棉花氮素利用率的影响。取得主要研究结果如下：
　　1.陆地棉GhGS1基因的克隆与进化分析
　　首先从陆地棉中克隆了GhGS1基因（Gh_D07G1773），生物信息学分析显示该基因位于7号染色体上，含有一个1071 bp的ORF框，编码356个氨基酸残基，蛋白分子量为39 kDa，等电点pI为5.92。将其ORF推导的氨基酸序列与其他物种进行同源性比对，其结果显示：GhGS1与水稻、大豆、拟南芥、玉米等植物的GS1同源性较高。拟南芥中的GS基因家族被分为2类（GS1、GS2），从陆地棉基因组检索出14个与拟南芥GS同源的基因。进一步进化树分析显示：克隆的陆地棉GhGS1基因与拟南芥AtGS1基因分在同一个亚家族，且与AtGLN1;1基因亲缘关系最近。
　　2．GhGS1基因的表达特性分析
　　采用Real-Time quantitive PCR技术来探究GhGS1基因在棉花生长过程中的表达特性。结果显示，GhGS1基因在根中表达量最高，雄蕊表达量较高，叶片表达量最低。
　　用不同供氮水平营养液处理棉花幼苗，结果显示：当棉花幼苗生长于适氮水平（5 mM）时，GhGS1基因在棉花的侧根表达量最高，其次是在主根。当棉花幼苗生长于0.5 mM和1 mM两种低氮水平时，无论地上部分（子叶、下胚轴），还是地下部分（侧根和主根），其GhGS1基因的表达量明显高于适氮水平，说明低浓度氮能诱导GhGS1基因的表达，并且在子叶中的这种诱导作用更明显。
　　3．GhGS1基因启动子序列的克隆与表达特性分析
　　通过设计特异性引物，以棉花基因组DNA为模板，克隆获得了1965 bp的GhGS1基因启动子序列（PGhGS1）。Plantcare顺式作用元件数据库分析PGhGS1序列，发现在该调控序列中含有丰富的核心序列，转录起始位点（TATA-box）和转录增强子（CAAT-box）。同时也含有丰富的光反应、激素反应及胁迫反应元件，表明GhGS1基因的表达会受到多种因素的影响。
　　将 GUS基因与 GhGS1启动子序列融合，构建植物表达载体pBI121-PGhGS1::GUS，并分别转入棉花及拟南芥，对获得的 T1代转基因植株进行GUS组织化学染色。结果显示，GhGS1基因启动子在棉花的各个部位均有染色，在根、雄蕊、茎的染色较深，表达较强。染色结果与Real-Time PCR检测的GhGS1基因在棉花中的表达特性大致吻合。GhGS1基因启动子在拟南芥除成熟叶片外的其他各个部位均能检测到GUS信号，其在根、茎、雄蕊、雌蕊的表达信号较强。该基因启动子在拟南芥和棉花中的表达模式基本一致。
　　4．超量表达GhGS1基因可在一定程度上提高棉花对低氮胁迫的适应能力。
　　为了进一步研究低氮条件下GhGS1基因在棉花中对氮素的利用情况，构建了CaMV35S组成型启动子控制的GhGS1超量表达载体，并转化棉花，经筛选获得了超量表达 GhGS1转基因棉花植株。在正常施肥水平营养钵中生长的超量表达GhGS1棉花 T1代植株与野生型棉花均生长良好，叶绿素含量差异不显著。分别对野生型棉花、超量表达GhGS1转基因棉花T2植株进行低氮胁迫处理发现，经适氮水平水培（氮浓度为5 mM），超量表达GhGS1棉花植株与野生型棉花叶片都呈深绿色，生长状态良好，叶绿素含量无明显差异，而在低氮水平（氮浓度为0.1 mM）生长条件下，野生型棉花叶片发黄，老叶尤为明显，而超量表达GhGS1棉花植株的叶片仍生长良好。叶绿素含量检测结果显示，超量表达转基因植株叶片中叶绿素含量明显高于野生型；植株总氮含量检测结果也显示，超量表达转基因植株总氮含量明显高于野生型。以上数据显示，低氮胁迫下超量表达 GhGS1基因可提高棉花叶片中叶绿素含量，有利于维持叶片的正常功能，也能增加植株中氮含量，为植株生长提供比较充足的氮，从而在一定程度上提高棉花对低氮胁迫的适应能力。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 棉花生长发育与氮素营养

1.2 植物同化氮素的途径

1.3 植物体内与氮吸收有关的酶

1.4 谷氨酰胺合成酶概述

第二章 引言

2.1立题依据

2.2技术路线

第三章 材料与方法

3.1 材料

3.2 方法

第四章 结果与分析

4.1 GhGS基因的生物信息学分析

4.2 GhGS1基因在棉花不同组织器官中的表达特性分析

4.3 不同因素对GhGS1基因表达的影响

4.4 GhGS1启动子的克隆及表达模式分析

4.5 GhGS1超量表达载体的构建及转基因棉花植株的获得

4.6 超量表达GhGS1基因对棉花生长发育的影响

第五章 讨论

5.1 植物体内的氮同化途径是一个受多种因素调控的复杂的过程

5.2 超量表达GhGS1基因对棉花耐低氮胁迫能力的影响

5.3 GhGS1基因可能参与棉花种子和纤维发育的过程

第六章 结论

6.1 主要结论

6.2 论文创新点

参考文献

附录一 缩略词表

附录二

致谢