水稻类病斑突变体spl34的遗传分析与精细定位

摘要

类病斑突变体（Disease lesion mimic mutants）是指植物在未受逆境胁迫或病原菌侵害的情况下，在其叶片或叶鞘等部位自发产生类似于过敏反应时所形成的坏死病斑的一类突变体。在类病斑的形成过程中通常会伴随着细胞程序性死亡，活性氧的积累，防卫相关基因的表达量上调以及水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号分子的合成量增加。在大量已报道的类病斑突变体中，很多还表现出抗性增强的特性，因此类病斑突变体可作为人类研究植物抗病机理和细胞程序性死亡的良好材料。在水稻中，由于很多类病斑突变体对稻瘟病和白叶枯病表现出抗性增强的特性，因此，类病斑突变体能够为人类培育抗性优良的品种提供丰富的种质资源。
　　本研究利用化学诱变剂EMS（ethyl methane sulfonate）处理水稻籼型恢复系“缙恢10号”从其后代中筛选到一个遗传稳定的类病斑突变体spl34。以野生型“缙恢10号”和突变体spl34为材料，进行了形态学鉴定、农艺性状考察、光合色素含量测定、叶绿体的荧光显微镜观察、组织化学分析、生理生化指标测定等方面的研究，并以表型正常的西农1A与突变体spl34杂交构建群体，F1和F2代用于遗传分析与基因定位，主要研究结果如下。
　　1.形态学鉴定
　　突变体spl34从分蘖后期开始在下部叶片的叶鞘上出现褐色的类病斑，随后褐斑沿着中脉扩散然后分布于整个叶片。至成熟期，褐色类病斑扩散至整个植株。遮光实验表明突变体类病斑的形成受光诱导。
　　2.农艺性状考察
　　成熟期分别对野生型和突变体的株高、穗长、穗粒数、结实率和千粒重等农艺性状进行考察。结果显示，突变体的株高和穗长均较野生型降低，达到了显著差异水平，而千粒重、穗粒数和结实率的降低程度则达到了极显著差异水平。
　　3.光合色素含量测定
　　抽穗期分别对野生型和突变体spl34的光合色素含量进行测定。结果显示，突变体 spl34的倒一叶光合色素含量均略高于野生型但未达到显著差异水平，而倒二叶和倒三叶光合色素含量则均较野生型低且分别达到了显著差异水平和极显著差异水平。
　　4.叶绿体的荧光显微镜观察
　　抽穗期取野生型和突变体spl34的叶片用于荧光显微镜观察发现，突变体spl34的叶绿体产生的红色荧光现象较野生型的弱，且突变体中出现类病斑的部位叶绿体产生的红色荧光也较未出现类病斑的部位弱。
　　5.组织化学分析
　　台盼蓝染色和DA B染色结果显示，突变体在类病斑形成部位发生了细胞程序性死亡和过氧化氢沉积。
　　6.生理生化指标测定
　　抽穗期对野生型和突变体spl34的各项生理指标进行检测。结果显示，突变体中CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性均较野生型的低，而且突变体中产生类病斑的部位H2 O2和O2-的含量均比野生型高，?OH的含量则与野生型无明显差异。7.稻瘟病抗谱测定与抗性鉴定
　　稻瘟病抗谱测定结果显示，突变体spl34对ZA生理群的抗病频率比野生型高，而对ZB生理群的抗病频率比野生型低，对ZC、ZD、ZE和ZG生理群的抗病频率则与野生型相同。抗性鉴定结果显示，突变体苗瘟、叶瘟病情指数和穗颈瘟的病穗率均比野生型略高，但差异并不显著。
　　8.遗传分析和基因定位
　　遗传分析结果表明，突变体spl34的表型受一对隐性核基因控制。该基因定位于第4染色体的LR49和 LR52两个分子标记之间，物理距离为200Kb。测序分析发现该区间内的候选基因：LOC_Os04g56480的第3449位碱基发生突变（G3449T），导致氨基酸替换由色氨酸突变为半胱氨酸。该基因与已报道的HM47为等位突变基因。
　　9.目的基因与防卫相关基因的表达
　　qRT-PCR结果表明，与野生型相比，目的基因在突变体中的表达量下降；而用于进行表达分析的病程相关基因和稻瘟病抗性基因中，除了 P R1a、P R1b和NPR1三个病程相关基因在突变体中的相对表达量显著升高外，其余的病程相关基因和稻瘟病抗性基因的相对表达量均未出现上升。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 水稻类病斑突变体的来源与命名

1.2 类病斑突变体的表型特征与分类

1.3 类病斑突变体的发生机制

1.4 类病斑突变体的抗病性研究

1.5 类病斑突变体和防卫信号途径

1.6 水稻类病斑突变体基因的克隆

1.7 类病斑突变体在分子育种中的应用

第2章 引言

第3章 材料与方法

3.1 实验材料

3.2 实验方法

第4章 结果与分析

4.1 突变体spl34的表型特征和农艺性状

4.2 遮光实验结果

4.3 光合色素含量的变化

4.4 叶绿体自发荧光观察结果

4.5 突变体叶片的细胞程序性死亡和H2O2积累

4.6 突变体生理指标的变化

4.7 突变体的稻瘟病菌抗谱测定和稻瘟病抗性鉴定

4.8 突变体的遗传分析

4.9 突变体的基因定位、候选基因分析及测序

4.10 目的基因、病程相关基因和稻瘟病抗性基因的表达分析

第5章 讨论

5.1 spl34基因的表达蛋白

5.2 突变体spl34和HM47表型特征的比较

5.3突变体spl34的PCD及其表型受光照的影响

5.4突变体spl34的稻瘟病抗性

5.5 关于突变体spl34的生理指标

第6章 结论

参考文献

致谢

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