尼罗罗非鱼两个ERβ基因敲除系的建立及其功能解析

摘要

雌激素在鱼类性别决定、分化与维持中起着关键的作用，但其作用机制有待阐明。雌激素的作用主要通过其核受体（Estrogen receptor，ER）介导。与多数硬骨鱼类一样，尼罗罗非鱼有3个雌激素受体亚型：ERα，ERβ1和ERβ2。在尼罗罗非鱼中，是哪个受体介导雌激素在性别决定中起作用，雌激素受体转录调控的与性别决定直接相关的下游靶基因及其转录调节作用的机制仍是未知的。近年来，雌激素受体的特异性激动剂和拮抗剂的开发及本实验室首次在养殖鱼类建立的CRISPR/Cas9系统，为揭示雌激素在罗非鱼性别决定与维持中的作用以及所涉及的机制提供了强有力的手段。本研究拟通过体外转录激活和 CRISPR/Cas9介导的基因敲除两种方法，对两个 ER??在性别决定中的作用进行功能研究。研究结果如下：
　　1）罗非鱼 ER特异的激动剂和拮抗剂的筛选。离体实验表明，雌激素 E2（17β-Estradiol, E2）通过ERα，ERβ1和 ERβ2以剂量依赖方式诱导荧光素酶的活力，EC50分别为1.9×10-9M，1.6×10-12M，2.9×10-10M，且雌激素对ERβ亚型的结合能力是ERα的100倍左右。其次，本研究利用GAL4系统检测哺乳类ER的激动剂和拮抗剂对尼罗罗非鱼3个ER活性的影响，筛选出罗非鱼ER各自特异的激动剂和拮抗剂。研究结果表明:哺乳类ERβ特异的激动剂WAY只能特异的激活罗非鱼ERβ2的活性，而对ERα和ERβ1无转录激活作用；哺乳类ERβ特异的拮抗剂PHTPP对罗非鱼ERβ1和 ERβ2的活性有显著地抑制作用，而对ERα无抑制作用。哺乳类ERα特异的激动剂PPT和拮抗剂MPP对罗非鱼3个ER都无特异性的激活和抑制作用。说明哺乳类ER的激动剂和拮抗剂并不能完全适用于罗非鱼的3个ER。
　　2）罗非鱼 ERβ基因突变系的建立。利用 CRISPR/Cas9基因靶向编辑技术，分别在尼罗罗非鱼敲除雌激素受体ERβ的2个亚型（ERβ1和 ERβ2）。基因敲除的靶位点分别位于 ERβ1的第5个和 ERβ2第4个外显子上，选择靠近 PAM（Protospacer adjacent motif，PAM，原型间隔基序）区的限制性内切酶 BtsIMutI和Hpy188I，用于ERβ1和ERβ2 F0代基因敲除阳性鱼的筛选。将ERβ1（突变率为46％）和ERβ2（突变率为90%）F0代XY阳性雄鱼分别和野生型XX雌鱼杂交，获得 F1代个体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）进行筛选，17尾为ERβ1+/-杂合突变鱼，7尾为ERβ1+/+野生型鱼，阳性率为70.8%。将筛选的ERβ1+/-鱼的PCR产物亚克隆测序，结果显示，突变鱼中既检测出了移码突变（-13bp，-5bp，-2bp，+11bp，+11bp）又检测出了非移码突变（-39bp）。同样，筛选的21尾ERβ2 F1代，12尾为ERβ2+/-杂合突变鱼，9尾为ERβ1+/+野生型鱼，阳性率为57.1%。突变鱼中既检测出了移码突变（-11bp，+7bp）又检测出了非移码突变（-6bp）。选取有移码突变 ERβ1（-13bp）和 ERβ2（-11bp）的 XY与XX杂合子交配获得纯合突变的F2。
　　3） F1代性腺组织学和免疫组织化学检测表明，在孵化后120和180天（dah， days after hatching）时，野生型ERβ+/+XX鱼的卵巢充满II时相的卵母细胞，而ERβ1+/-XX鱼的卵巢仍被卵原细胞和少量I时相的卵母细胞中所充满。免疫组织化学结果表明，与对照鱼相比,雌激素合成酶 Cyp19a1a和生殖细胞标记 Vasa在ERβ1+/-杂合敲除鱼性腺正常表达，而Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞标记42Sp50的阳性细胞明显减少。这些结果表明敲除ERβ1的杂合子可能因单倍剂量不足导致XX鱼卵巢卵子发生明显延迟。相反，在120和180 dah对ERβ2+/-XX鱼性腺没有明显的表型，其卵巢与野生型卵巢一样充满II时相的卵母细胞。性成熟后，无论XX和XY ERβ1+/-杂合敲除鱼还是ERβ2+/-杂合敲除鱼都是可育的。通过姊妹交均获得了纯合敲除鱼。
　　4）F2代性腺组织学和免疫组织化学检测表明，在30和90 dah，所有XX ERβ1-/-和 ERβ2-/-纯合敲除鱼都与 XX野生型一样表达 Cyp19a1a,不表达 Dmrt1，而 XY ERβ1-/-和ERβ2-/-都与XY野生型一样表达Dmrt1，不表达Cyp19a1a，从而说明无论单独敲除ERβ1和ERβ2都不会发生性逆转。这可能是由于敲除其中一个ERβ而另一个ERβ或ERα会补偿其功能。因此，还需要建立ERα单敲除、ER双敲除乃至三敲除模型做更进一步的研究。
　　综上所述，哺乳类ER的激动剂和拮抗剂不完全适用于罗非鱼的3个ER，还需要筛选ER各自特异的激动剂和拮抗剂来揭示它们介导雌激素决定罗非鱼性别的作用机制。分别纯合敲除ERβ1和ERβ2在早期没有发生性逆转的现象。但是ERβ1和ERβ2敲除模型的建立为后续建立ER双敲除及三敲除模型，以及深入解析雌激素及通过哪个（哪些）ER在性别决定、分化和维持中的作用奠定了坚实的基础。

目录

声明

中英文缩略语对照表

1. 文献综述

1.1脊椎动物性别决定和分化研究进展

1.1.1脊椎动物遗传性别决定

1.1.2脊椎动物环境性别决定

1.1.3脊椎动物性别分化

1.2 雌激素在性别决定、分化与卵巢维持方面的作用

1.2.1雌激素的生物合成

1.2.2雌激素在性别决定和分化中的作用

1.2.3雌激素在卵巢维持中的作用

1.3雌激素受体研究进展

1.3.1 雌激素受体的结构与功能

1.3.2 雌激素受体的作用机制

1.3.3 鱼类雌激素受体研究进展

1.3.4 雌激素受体与配体的亲和力及转录激活作用

1.4 科学问题的提出和本研究的目的意义

2. 罗非鱼ER体外转录激活作用检测

2.1 引言

2.2 材料、仪器和方法

2.2.1 菌种

2.2.2 试剂与仪器

2.2.3 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 ER氨基酸序列比对

2.3.2基因结构分析

2.3.3 ER-LBD PCR扩增片段

2.3.4 重组质粒鉴定

2.3.5 测序鉴定

2.3.6 报告基因系统检测雌激素对ER的激活作用

2.3.7 GAL4系统检测雌激素及激动剂对ER的激活作用

2.3.8 GAL4系统检测雌激素拮抗剂对ER的拮抗作用

2.4 讨论

3.尼罗罗非鱼ERβ基因敲除系的建立及其功能解析

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 实验动物

3.2.2 主要试剂和载体

3.2.3 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 ERβ在不同发育时期性腺中表达模式

3.3.2 CRISPR/Cas9成功敲除罗非鱼ERβ基因

3.3.3 ERβ基因敲除F1的建立及筛选

3.3.4 ERβ基因敲除F2的建立及筛选

3.3.5 ERβ突变对卵巢发育的影响

3.3.6 ERβ纯合敲除对罗非鱼性腺发育的影响

3.4 讨论

结论

展望

参考文献

致谢

在读期间发表论文情况

在读期间参与科研情况