不同pH紫色土中硝化作用及硝化微生物宏基因组研究

摘要

紫色土作为我国特有的土壤资源，广泛分布于以四川盆地，该区紫色土占全国紫色土总面积的90％以上，而且较为肥沃，矿质元素丰富，是当地重要的农业土壤资源。众所周知，土壤中发生的硝化作用与农业环境污染密切相关，且是对pH高度敏感的生物化学过程，pH被认为是影响硝化作用及硝化微生物的一个关键因素。由于pH对土壤中发生的各种物理、化学以及生物过程都有着广泛的影响，其对土壤硝化作用的效应是综合的，弄清土壤pH对硝化作用的影响机制对于提高氮肥利用率和降低环境污染具有重要意义。
　　首先，本文以四川盆地三种不同pH的紫色土为研究对象（酸性紫色土 pH5.7；中性紫色土 pH7.3；石灰性紫色土 pH8.0），通过人为加酸或碱将三种不同初始pH的紫色土短期调节pH分别获得3个pH梯度的土壤子样品，添加8 mmol N kg-1硫酸铵保持田间持水量的60%置于28℃恒温培养箱黑暗培养，定期采样测定土壤硝态氮、铵态氮、pH值、氨氧化微生物丰度，研究pH的长期和短期改变对土壤硝化作用及氨氧化微生物的影响。结果如下：
　　（1）三种不同pH紫色土原样在9天的培养过程中平均净硝化率为石灰性紫色土（7.02 mg kg-1d-1）>中性紫色土（2.42 mg kg-1d-1）>酸性紫色土（-0.23 mg kg-1d-1），土壤硝化作用的强度与pH呈显著正相关。三种不同pH紫色土原样中AOA/AOB比值为：酸性紫色土（126）>中性紫色土（1.55）>石灰性紫色土（0.6），说明酸性紫色土中AOA在数量上占主导地位，石灰性紫色土中AOB在数量上占主导地位，而在中性紫色土中AOA与AOB在数量上相当，可能都在硝化作用过程中起一定作用。
　　（2）酸性紫色土三个子样品平均净硝化率为：-0.23、-0.22、-0.23 mg kg-1d-1；中性紫色土三个子样品pH6.5-H2SO4，pH7.3，pH8.1-NaOH的平均净硝化率分别为：1.23、2.42、3.27 mg kg-1d-1；石灰性紫色土三个子样品平均净硝化率为：7.05、7.04、7.02 mg kg-1d-1。说明酸性及石灰性紫色土中，短期改变土壤pH并不能显著影响其硝化作用，而在中性紫色土中，短期提高或降低土壤pH会相应地增强或减弱其硝化作用强度。三种不同pH的紫色土子样品间AOA与AOB丰度无显著差异，且培养期间的变化趋势相同，表明短期改变pH不会显著影响土壤AOA和AOB的数量。
　　（3）双因素方差分析发现长期pH改变对硝化作用影响极显著（F=569.547， P＜0.001），短期pH改变对硝化作用影响显著（F=4.723，P=0.02），长期pH改变对硝化作用的影响大于短期pH改变对硝化作用的影响。
　　根据培养实验的结果，推测pH长期短期改变对硝化作用的影响机制不同， pH的长期改变是通过影响硝化微生物来影响硝化作用，为证明这一推测，对三种不同pH土壤原样提取总微生物DNA，运用Hiseq高通量测序技术对土壤中所有微生物进行测序分析，揭示长期pH改变对土壤微生物群落结构及功能基因的影响，结果如下：
　　（1）Hiseq高通量测序总共发现89门，222纲，527目，1009科，2769属，14354种。所有土样中检测到10种相同的优势菌群，中性紫色土检测到一个独有的优势菌群Nitrospirae（硝化螺菌门），石灰性紫色土缺少优势菌群Thaumarchaeota（奇古菌门），Proteobacteria（变形菌门）在三种紫色土中均占比最多。
　　（2）在所有序列中挑选功能基因发现，nxrA在所有土壤中占比最大，其次为nxrB，与AMO相关的功能基因在中性土占比最大，其次为石灰性土，酸性土最小，而且酸性土中没有检测到hao基因，石灰性土中的hao基因占比最大。
　　（3）对微生物群落和土壤性质的相关性分析发现土壤的pH值、有机质、总氮、铵氮、硝氮和田间持水量对土壤微生物的群落结构都具有显著的相关性，且土壤pH对微生物群落的影响最大（r2=0.9985, P=0.001）；通过冗余分析发现，三种不同pH紫色土的微生物群落结构差异很大。总氮，田间持水量，有机质和铵氮是影响酸性紫色土微生物群落的主要因素，而pH和硝氮则分别对中性及石灰性紫色土群落结构的影响明显。
　　综合全文分析发现，三种不同pH紫色土中微生物群落结构差异极大，土壤pH与硝化作用呈显著正相关，pH长期改变是通过改变土壤硝化微生物群落结构和功能来影响硝化作用，而pH的短期改变是通过改变底物有效性来影响土壤硝化作用。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 土壤中硝化作用的研究意义

1.2 硝化作用的研究进展

1.3 硝化微生物

1.4 土壤pH对硝化作用及硝化微生物的影响

1.5 土壤宏基因组研究方法

第2章 绪论

2.1 研究背景

2.2 研究目的

2.3 研究内容

2.4 技术路线

第3章 材料与方法

3.1 研究区域概况

3.2土壤样品采集与处理

3.3 土壤样品培养

3.4 土壤样品理化性质测定

3.5 微生物总DNA提取

3.6分子生物学方法

3.7 数据处理

第4章 结果与分析

4.1 长期与短期pH改变对紫色土硝化作用的影响

4.2 三种不同pH紫色土原样的宏基因组研究

第5章 讨论

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

发表论文及参与课题