用于F1代植株含转基因成分的花粉和卵细胞的致死系统的构建与验证

摘要

转基因改良因具有目的性强、可征用任何物种的遗传资源、可改良和创新农艺性状、可加快育种进程等优点而受到园艺学及农艺学育种研究者的重视，已经成为现代作物育种研究的重要手段。然而，防止转基因漂移是转基因植物的推广中一个备受关注和必须解决的重大问题。目前，防止转基因植物中外源基因通过花粉和种子进行漂移的主要手段有雄性不育及种子不育等。但这种方法导致的花粉不育和种子不育将造成无法结实，因此，只能用在无性繁殖作物上，并不适合以种子和果实等繁殖器官为主要产品的作物。为此，转座子技术、位点特异性重组酶技术及同源重组技术等被相继应用于植物的转基因安全控制中以解决转基因通过花粉、种子漂移和结实、产生种子之间的矛盾。同源重组技术、转座子技术及均存在着转基因成分删除效率低等问题，不能满足在实际生产中大规模种植转基因植物的安全控制需要。在转基因植物外源基因删除技术中被研究最多同时应用最广泛的是位点特异性重组酶技术。其中，对于 Cre/LoxP重组酶系统的研究目前最深入，应用也最为广泛。Cre/LoxP重组酶系统具有高效、快速及精准等优点。目前已经有很多研究应用组织特异性表达启动子控制 Cre/LoxP系统在转基因植物中获得了不含转基因成分的花粉、种子及果实，但是这些系统并没有解决使F1代转基因植株保持杂种优势的同时花粉、果实和种子不含有转基因成分的问题。本文分别用AtPKL种子萌发特异启动子和TAGiLAT雄蕊/雌蕊特异启动子通过四环素-热激负调节基因表达系统中介后控制 Cre/LoxP重组系统，以拆分形式整合进T0代转基因亲本的染色体，经模拟杂交过程的共转化整合后，在含有AtPKL种子萌发特异启动子的 T1代转基因植株种子萌发阶段或者含有TAGiLAT雄蕊/雌蕊特异启动子的T0代转基因植株雄蕊雌蕊发育阶段，自动删除卡那霉素抗性基因等组件、使隔断的花粉/卵细胞特异表达启动子与 Barnase致死基因发生重组，杀死带有转基因成分的花粉和卵细胞，获得无选择标记基因的、不含转基因成分的种子和果实。该方法经进一步改良后，有望用于解决以种子或/和果实为产品器官的F1代转基因作物的转基因漂移难题。
　　本研究主要内容包括：⑴构建了含有热激诱导/四环素抑制的基因表达调控系统的表达载体pVCT2041并转入烟草中进行了验证。组织化学染色、定量酶活分析及qRT-PCR的分析结果表明，在热激条件下，该系统所控制的报告基因表达达到了类似于CaMV35S启动子的水平，而在非诱导条件下，该系统有着与HSP70m热激启动子类似的背景表达水平，同时，在四环素存在的条件下，该系统所控制的GUS基因表达可以在热激环境中被有效的抑制。⑵根据GenBank中公布的拟南芥萌发启动子AtPKL的序列，设计特异性引物，克隆了拟南芥萌发启动子AtPKL。AtPKL所控制的GFP基因在种子吸水后1 h开始表达，并且持续表达于转基因烟草植株生长发育的各时期及各部位，而在种子发育过程中及未吸水的干燥种子中不表达。⑶据GenBank中公布的番茄花粉特异启动子LeLAT52和拟南芥卵细胞特异启动子DD45的序列，设计特异性引物，拼接构建了花粉/卵细胞特异启动子Pol/Egg。构建双元表达载体pVCT2324，由HSP70m热激启动子控制Cre重组酶基因，在热激条件下，Cre重组酶基因表达后使花粉/卵细胞特异表达启动子Pol/Egg与LoxP-Ω-Barnase::T35s片段重组，从而使带有转基因的花粉和卵细胞致死。热激重组后pVCT2324转基因烟草植株后代单花花粉数量、单果种子数量及带有转基因成分的比率较热激重组前明显下降、花粉出现了败育，4个株系经热激重组后的单花正常花粉量由2.3×105±0.94×105、2.2×105±0.66×105、2.4×105±0.87×105和2.3×105±0.86×105减少为1.4×105±0.65×105、1.3×105±0.43×105、1.2×105±0.54×105和1.5×105±0.59×105；单果种子数量由733.4±2.7、656.4±2.3、720.6±5.4和679.3±5.4减少为323.2.±2.5、334.6±3.6、420.6±2.8和383.4±3.6；种子携带转基因成分的比率由98.03%、96.07%、96.7%和93.31%分别下降到了18.73%、28.22%、19.52%和23.18%。⑷用AtPKL种子萌发特异启动子或TAGiLAT雌蕊/雄蕊特异表达启动子通过四环素热激负调节基因表达系统中介后控制Cre/LoxP重组系统，以拆分形式共转化整合进烟草中异源染色体，经共转化整合后，在 T1代转基因植株萌发期间或 T0代转基因植株雄蕊/雌蕊发育阶段自动删除卡那霉素抗性基因等组件、使隔断的花粉/卵细胞特异表达启动子与Barnase基因发生重组，从而致死带有转基因成分的花粉和卵细胞。构建了双元表达载体pVCT2419、pVCT2420和pVCT2421，分别将pVCT2419与pVCT2420、pVCT2419与pVCT2421共同整合进烟草的基因组。整合了pVCT2419和pVCT2420及共同整合了pVCT2419和pVCT2421的转基因烟草植株单花花粉数量、单果种子数量及种子带有转基因成分的比例较单独整合pVCT2419、pVCT2420和pVCT2421的转基因烟草株系明显下降，证明共同转化的转基因植株中带有转基因成分的花粉及卵细胞被致死清除。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1 植物转基因生物安全研究进展

1.2 化学诱导及四环素调控基因表达的研究进展

1.3 热激调控系统的研究进展

1.4 Cre/lox重组系统的研究进展

第2章 引言

2.1 研究目的意义

2.2 研究主要内容

2.3 技术路线流程

第3章 热激诱导/四环素抑制的基因调控表达系统的构建与验证

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 拟南芥萌发启动子AtPKL在烟草中的表达特性分析

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

第5章 热激控制的转基因花粉和卵细胞致死系统的构建与验证

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

第6章 可用于F1代转基因花粉/卵细胞致死的调控系统的构建与验证

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.3 结果与分析

6.4 讨论

6.5 小结

第7章 主要结论及创新点

7.1 主要结论

7.2 创新点

参考文献

附录1 缩略词表

附录2 学习期间参加的主要科研项目

附录3 发表的论文

致谢