桔小实蝇Tachykinin和Natalisin信号系统的生理功能及其药靶潜力评估

摘要

桔小实蝇是重要的农业害虫，由于寄主范围广、适应能力强以及抗药性发展快速等因素，对其持续防控愈发困难。神经肽是昆虫体内一种重要的信号分子，通过激活G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）调控昆虫多种生理功能，阻断或扰乱神经肽信号系统的信号传导，能够达到控制害虫的目的。因此，神经肽信号系统被认为是一种理想的杀虫剂靶标。本学位论文基于桔小实蝇基因组和中枢神经系统（Central nervous system）转录组数据，利用生物信息学方法，对桔小实蝇神经肽前体基因进行鉴定及注释；克隆获得2个近似神经肽Tachykinin（Tachykinin related-peptide，TRP）和Natalisin（NTL）前体及其受体基因的 cDNA序列，并解析了桔小实蝇 TRP（BdTRP）和 NTL（BdNTL）及其受体（BdTRPR和 BdNTLR）基因结构信息；采用实时定量 PCR（qPCR）技术，分析BdTRP和 BdNTL及其受体在桔小实蝇体内的时空表达模式；运用免疫组化（Immunohistochemistry）和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization）技术，定位桔小实蝇脑部表达 BdTRP和 BdNTL的神经元；通过 RNA干扰（RNA interference，RNAi）、触角电位（Electroantennogram，EAG）以及行为学分析技术和方法，确定桔小实蝇TRP和NTL信号系统承担的具体生理功能；利用中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞表达系统及胞内钙离子流动测定技术，分别对 BdTRPR和 BdNTLR进行功能性测定及药理学分析，并以此建立靶向BdTRPR和BdNTLR的激动剂和拮抗剂的高通量筛选平台；最后，利用该筛选平台对13个神经肽类似物进行了靶向活性筛选和评价。
　　本研究主要内容包括：⑴基于桔小实蝇基因组和中枢神经系统转录组数据，鉴定及注释了39个桔小实蝇的神经肽前体基因。序列分析结果发现，桔小实蝇大多数神经肽前体具有典型的结构特征，即“信号肽+成熟肽+前体相关肽”；成熟肽的切割位点保守，一般为赖氨酸残基（K）和精氨酸残基（R）组合；大多数成熟肽C端具有酰胺化修饰位点。此外，Adipokinetic hormone、Allatostatin C（AST-C）、Corazonin和Diuretic hormone44成熟肽的N端存在谷氨酸环化形成的焦谷氨酸；AST-C、Allatostatin CC（AST-CC）、Crustacean cardioactive peptide、CCHamide、CNMamide、Insulin-like peptide和Neuroparsin成熟肽的半胱氨酸之间存在二硫键；Sulfakinin成熟肽具有1个硫酸化的酪氨酸；CNMamide、Ion transport peptide和Orcokinin的前体基因存在选择性剪接现象；神经肽Neuropeptide F存在基因复制现象。⑵利用qPCR技术解析桔小实蝇BdTRP和BdTRPR的时空表达模式。结果表明，BdTRP和BdTRPR均在桔小实蝇的成虫期表达水平相对较高，在幼虫和蛹期的表达水平相对较低；值得注意的是，卵期BdTRPR的表达水平最高，而BdTRP的表达水平相对较低。桔小实蝇BdTRP和BdTRPR组织特异性的表达模式分析结果表明，BdTRP主要在桔小实蝇中枢神经系统和中肠高水平表达，而其受体 BdTRPR在成虫组织中的表达较为广泛，在中枢神经系统、中肠、后肠及触角均能检测到表达。⑶利用qPCR技术解析桔小实蝇BdNTL和BdNTLR的时空表达模式。结果表明，BdNTL和BdNTLR均在蛹和成虫期的表达水平相对较高，在幼虫期的表达水平相对较低，卵期BdNTL的表达水平最高，而其受体BdNTLR的表达水平则较低。桔小实蝇BdTRP和BdTRPR组织特异性的表达模式分析结果表明，BdNTL主要在中枢神经系统高水平表达，而其受体 BdNTLR除在中枢神经系统表达外，在后肠、触角、卵巢和精巢也有一定的表达水平。利用免疫组化和荧光原位杂交技术，分别在蛋白和mRNA水平对桔小实蝇成虫脑部分泌BdNTL的神经元进行定位分析。免疫组化分析结果显示，在蛋白水平，桔小实蝇成虫的脑部有13对神经元分泌 BdNTL。其中，DLP和前脑间部小神经元各有2对神经元分泌BdNTL，PDLP有7对神经元分泌BdNTL。此外，在前背外侧中间神经元（Anterior dorsolateral interneuron，ADLI）和下对侧中间神经元（Inferior contralateral interneuron，ICLI）各有1对神经元分泌BdNTL。荧光原位杂交结果显示，在mRNA水平，发现在DLP、ADLI和ICLI各有1对神经元表达BdNTL。在幼虫脑部表达BdNTL的神经元较少，免疫组化分析结果显示，在幼虫脑部有6对神经元分泌BdNTL，而荧光原位杂交分析结果显示幼虫脑部仅有2对神经元表达BdNTL。⑷利用CHO细胞表达系统实现对桔小实蝇TRP和NTL受体的功能性表达，采用细胞内钙离子流动测定的方法建立两个受体的功能测定体系。利用该技术体系，测定了TRP和NTL受体各自内源配体的有效中浓度（50%effective concentration，EC50），并以此确定各自的模式配体。结果显示，BdTRP5为BdTRPR的模式配体，BdNTL2为BdNTLR的模式配体。活性测定结果表明，BdNTL2能在1μM浓度下完全激活 BdTRPR，而同样浓度的 BdTRP5也能完全激活 BdNTLR，说明在离体条件下，两个信号系统间存在交互效应。⑸利用该技术体系搭建靶向BdTRPR和BdNTLR的激动剂和拮抗剂的高通量筛选平台，对13个NTL/TRP类似物进行激动剂和拮抗剂活性测定。结果表明，13个化合物均无靶向 BdNTLR的有效激动剂或拮抗剂的活性。化合物1888[Φ1]wp-4和2120[Φ1]wp-1具有明显的靶向 BdTRPR的激动剂活性，且对BdTRPR的激活能力呈浓度依赖性关系，EC50值分别为4.9 nM和268.8 nM。化合物1887[Φ1]wp-3具有靶向BdTRPR的中度拮抗活性，且拮抗活性呈浓度依赖性关系，抑制中浓度（50%inhibitory concentration）为0.57μM。

目录

声明

第一章 文献综述

1G蛋白偶联受体

2 昆虫神经肽

3 昆虫Tachykinin及其受体的研究进展

4 昆虫Natalisin及其受体的研究进展

5 学位论文研究的目的与意义

第二章 桔小实蝇神经肽前体基因的鉴定及注释

第一节 神经肽前体基因的鉴定及注释

第二节 NTL和TRP及其受体的克隆及序列分析

本章讨论

第三章 桔小实蝇TRP信号系统的生理功能研究

第一节 TRP及其受体的时空表达模式分析

第二节 TRP在桔小实蝇脑部的定位分析

第三节 TRP信号系统对桔小实蝇嗅觉敏感性的影响

本章讨论

第四章 桔小实蝇NTL信号系统的生理功能研究

第一节 NTL及其受体的时空表达模式分析

第二节 NTL在桔小实蝇脑部的定位分析

第三节 NTL信号系统对桔小实蝇交配率的影响

本章讨论

第五章 桔小实蝇TRP与NTL受体的激动剂和拮抗剂筛选

第一节 NTL与TRP受体的功能性表达

第二节 TRP与NTL受体的激动剂和拮抗剂活性测定

本章讨论

第六章 主要结论、创新点及研究展望

1 主要结论

2 创新点

3 研究展望

参考文献

附录

博士在读期间发表的论文及参加科研课题情况

致谢