黄曲霉毒素B1亚慢性暴露对雄性小鼠氧化、遗传系统的损伤及其作用机制

摘要

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）是目前已知的真菌毒素中毒性最强、对人类威胁最大的一种毒素。由于其极强的致癌性，并且其化学结构稳定高温下难以被破坏分解，AFB1的暴露最终将会导致各类急性或亚慢性中毒的发生。虽然AFB1的致癌作用及其相关机理已被证实，但其对生物体造成的氧化性、遗传性损伤及其相关机制的研究并不十分明确，这并不利于对黄曲霉毒素（ Aflatoxins, AFT）的毒性机制的深入研究，同时也对 AFB1的防御体系建立造成了一定的阻碍。
　　本实验对 AFB1产生的氧化性、遗传性毒害作用及相关分子作用机制进行了研究，为全面评估 AFB1的毒性同时为阐明其他类别的黄曲霉毒素的毒性机理提供一定的借鉴，同时也为黄曲霉毒素的降解脱毒或防御体内中毒提供更多的参考。本实验首先选用40只雄性小鼠，在亚慢性条件下进行连续50天3种不同剂量（0.09375、0.375、1.5mg/kg b.w./day）的AFB1染毒，对血清及脏器中各氧化损伤指标、肝细胞凋亡及其相关信号通路等进行研究，以评估其造成的氧化性损伤及分子机制；对肝脏中 DNA链断裂、交联，细胞微核及精子畸形等指标进行考察，以评估其遗传毒性及分子机制。并研究体外条件下AFB1与DNA之间的相互作用机制及其与遗传毒性的相关性。具体的结果如下：
　　（1）经过50天的AFB1染毒后，AFB1对小鼠机体能够造成明显的脏器损伤、血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平的显著性升高。各染毒组小鼠体重随染毒剂量的增加而降低，且肝脏、肾脏、睾丸三种器官重量也出现下降趋势，表明该三种脏器受到AFB1染毒的影响。AFB1对机体造成的病理性损伤具体为：低剂量时以炎症效应为主，高剂量时则导致肝细胞局部坏死、肾小球肿胀及肾小管上皮细胞坏死等情况。
　　（2）亚慢性条件下，AFB1能够对小鼠肝脏产生明显的氧化性损伤。不同剂量的染毒组均能够导致肝脏中活性氧（ROS）的升高，中、高剂量组肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）水平下调表明其抗氧化系统受到损伤，无法启动清除过量的ROS，但低剂量组小鼠肝脏启动其抗氧化机制，免于机体受到过量ROS的损伤。中、高剂量组小鼠肝脏中脂质、蛋白、DNA均受到ROS的攻击，造成氧化性损伤，机体处于氧化应激状态，但低剂量 AFB1组小鼠体内的生物大分子物质并不受到显著性的损伤。
　　（3）AFB1产生的氧化性损伤除导致细胞坏死外，凋亡也是一种可能的方式，且肝细胞凋亡率随AFB1浓度的增大而升高，在本试验范围内具有剂量-效应关系。低剂量时 AFB1对细胞造成的影响主要以炎症、局部细胞坏死为主，而较大剂量时则以细胞凋亡为主。AFB1介导的肝细胞凋亡分子机制可能与上调 Bax、Caspase-3、P53蛋白，下调Bcl-2蛋白的表达有关。AFB1亚慢性染毒诱导的氧化性损伤中存在细胞凋亡的相关分子机制。这提示我们，若能从细胞凋亡的角度入手，更好的对其调控，将有可能为遏制AFB1的氧化毒性提供新的途径。
　　（4）亚慢性条件下的 AFB1暴露能够引起雄性小鼠肝细胞 DNA链断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白质交联形成，同时导致精子畸形率升高、微核形成及染色体损伤的增多。该五项指标除 DNA-DNA交联外，其余各项指标均随 AFB1剂量的增大而升高，并且具有剂量-效应关系，这说明AFB1不仅对体细胞而且对生殖细胞也具有遗传毒性，能产生致突变作用。
　　（5）当较大剂量的AFB1暴露于小鼠时（1.5mg/kg），DNA-DNA交联率并不随 AFB1浓度的增大而升高。这一结果表明，当 AFB1浓度增大到一定程度时（1.5mg/kg），其引发的各种DNA损伤形式中DNA-DNA交联的比例下降，推测其他形式的DNA损伤（如DNA链断裂、DNA-蛋白交联等）所占比重增大。AFB1产生遗传毒性的机制可能是机体氧化应激所产生大量ROS等自由基直接对DNA造成攻击，或是ROS介导的氧化应激间接导致DNA氧化损伤所形成的。
　　（6）AFB1不需经过代谢，能够直接与 DNA之间发生相互作用，形成二元复合物。同时DNA能够明显淬灭AFB1的内源荧光，其淬灭类型为静态结合动态淬灭的方式。两者的结合常数为4.12×103 L/mol；相互作用力主要为氢键和疏水相互作用；结合模式为沟槽结合。AFB1的结合导致DNA的构象有轻微的改变，但并没有对其构型造成较大的影响。分子对接结果说明，AFB1与DNA的结合位于小沟槽区，且AFB1的O6和O3原子能够和DA-17、DG16这两个碱基形成三个较强的氢键。这提示我们，AFB1对DNA造成的损伤可能存在新的作用方式，这种方式可能与其毒作用机制有关。
　　综上所述，亚慢性 AFB1的暴露能够对小鼠的氧化、遗传系统造成一定程度的损伤，并且其作用机制都与机体处于氧化应激状态、大量ROS的生成有关，这对于其致癌机制的研究与相关药物的开发具有指导意义。

目录

声明

第1章 文献综述

1.1黄曲霉毒素简介

1.2黄曲霉毒素的毒性

1.3 小分子物质与DNA的结合作用

第2章 引言

2.1 研究目的和意义

2.2 研究内容

第3章 亚慢性条件下AFB1暴露对雄性小鼠氧化系统的损伤及其作用机制

3.1 材料与设备

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 本章小结

第4章 亚慢性条件下AFB1暴露对雄性小鼠遗传系统的损伤及其作用机制

4.1 材料与设备

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第5章 黄曲霉毒素B1与DNA相互作用的机制及分子模拟研究

5.1 材料与仪器

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结

第6章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢

研究生期间发表论文