高良姜提取物抑制氧化应激引起的成骨细胞损伤和凋亡的作用研究

摘要

[目的]：
　　1.筛选高良姜促成骨分化的活性组分。
　　2.探讨H2O2诱导产生氧化应激引起成骨细胞损伤和凋亡以及高良姜抗骨质疏松活性组分的干预作用。
　　3.阐明H2O2诱导产生氧化应激对FoxO/Wnt信号通路的影响以及高良姜抗骨质疏松活性组分的干预作用。
　　[方法]：
　　1.高良姜干燥根茎粉碎后，98％乙醇萃取五次，溶液经浓缩蒸干后得到总提取物F1，F1用石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸(36∶64∶2)体系进行洗脱后根据极性由高到低得到F2，F3，F4，F5和F6。用高效液相色谱法（HPLC）对F1-F6中高良姜素的含量进行测定。色谱柱:phenomenex C18柱(46mm×250mm，5μm);流动相:乙腈-0.2％磷酸(48∶52);检测波长:266.8nm;流速:1.0ml/min;柱温:25℃;进样量:20μl。
　　2.采用酶消化法体外培养和纯化新生大鼠成骨细胞(OBs)，采用ALP染色、茜素红染色、HE染色及细胞形态学观察对原代成骨细胞进行鉴定，为研究提供合格的靶细胞。
　　3.用MTT法、PNPP法、茜素红染色法分别检测高良姜各提取物对体外培养的成骨细胞的细胞活力、碱性磷酸酶含量及钙化结节面积的影响，以观察提取物对成骨细胞增殖、分化及钙化能力的作用及其时效及量效关系，为初步筛选高良姜活性成分提供依据。
　　4.应用H2O2诱导氧化应激模型，采用MTT法、PNPP法、茜素红染色法分别检测在氧化应激状态下高良姜各活性组分对氧化应激介导的成骨细胞损伤的保护作用。
　　5.DCFH-DA探针法检测高良姜各活性组分对细胞内ROS水平的影响;应用Hoechst33258染色法观察高良姜各组分对氧化应激介导的成骨细胞凋亡的保护作用。
　　6.Western Blot法检测高良姜各活性组分对成骨细胞中Wnt/β-catenin及FoxO信号通路中关键蛋白FoxO3a、β-catenin及Tcf-4蛋白表达水平的影响。
　　[结果]：
　　1.高良姜各组分中高良姜素的百分含量测定
　　HPLC法检测高良姜各组分中高良姜素含量的结果显示，F1-F6中高良姜素的含量分别为0.512％、0.095％、0.38％、24.42％、0.19％、0.04％。
　　2.成骨细胞分离与鉴定
　　酶消化法分离和纯化得到的细胞呈贴壁生长，形态均一，呈长梭形或者多角形，有少量杂细胞游离。传代培养2代后，可得到纯化的成骨细胞。ALP染色可见细胞胞浆呈现大量紫色和深紫色颗粒，ALP染色阳性;茜素红染色结果显示钙结节经过茜素红染色后呈现出橘红色。
　　3.高良姜促成骨分化活性组分的初步筛选
　　以高良姜素（galagin，10-4g/ml-10-8g/ml）为对照组， F1-F6均以浓度为10-4g/ml-10-8g/ml作用于成骨细胞24h、48h和72h，结果显示，高良姜素10-5 g/ml浓度组在作用48h和72h能促进成骨细胞增殖(P＜0.05)，而10-5 g/ml在作用24h和其他浓度组均未见明显的促成骨细胞增殖作用。F1浓度为10-5 g/ml、F4浓度为10-6 g/ml和10-5 g/ml、F5浓度为10-6 g/ml、10-5 g/ml和10-4 g/ml作用24h、48h和72h均能促进成骨细胞增殖（P＜0.05），且其促成骨细胞增殖作用较高良姜素组作用要强。而F2、F3和F6在作用24h、48h和72h后均未见明显的促成骨细胞增殖作用。高良姜素（10-6 g/ml、10-5 g/ml）、F1(10-8 g/ml-10-5 g/ml)、F4(10-8g/ml-10-5 g/ml)和F5(10-8 g/ml-10-5 g/ml)还能促进成骨细胞胞浆内碱性磷酸酶的表达(P＜0.05)，其中高良姜素和F1、F4在作用第五天时达到高峰，F5在第七天达到高峰。而F2、F3和F6各浓度组在各时间段均未见明显的胞浆内碱性磷酸酶表达的增加。高良姜素和F1-F6作用成骨细胞21d后，茜素红染色结果显示，高良姜素、F1、F4和F5相对于对照组，矿化结节数量和面积明显增多，且在10-5 g/ml浓度组效果最佳。F2、F3和F6各浓度组细胞矿化结节数量和面积与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05）。
　　4.氧化应激对成骨分化的影响以及高良姜活性组分的干预作用
　　应用浓度为l0-100μM的H2O2处理成骨细胞4h后检测细胞活力，结果显示，H2O2浓度为70μM-100μM时，细胞活力随H2O2浓度增加而减少（P＜0.05），H2O2浓度为10μM-60μM时，细胞活力无明显变化（P＞0.05）。H2O2浓度90μM时，细胞活力下降50％，因此实验采用90μM的H2O2来复制氧化应激模型。H2O2能够引起细胞活力，胞浆内碱性磷酸酶表达水平及矿化结节数量与面积显著性减少（P＜0.05），浓度为10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能H2O2对抗这种作用增加(P＜0.05)。
　　5.氧化应激引起成骨细胞凋亡以及高良姜活性组分的干预作用
　　用浓度为90μM的H2O2处理成骨细胞30min后，细胞内ROS增加率达到36.8％（P＜0.05），浓度为10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能够显著地减少H2O2引起的ROS积累(P＜0.05)。90μM的H2O2作用于成骨细胞后，相对于对照组，凋亡小体和细胞核肿胀、碎裂数量增多(P＜0.05)，浓度为10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能够显著地减少成骨细胞凋亡(P＜0.05)。
　　6.高良姜组分在氧化应激状态下对FoxO/Wnt信号通路的影响
　　用90μM的H2O2处理成骨细胞后，β-catenin和Tcf-4蛋白表达减少，FoxO3a蛋白表达增加(P＜0.05)。浓度为10-5g/ml的高良姜素、F1、F4和F5均能够不同程度的逆转H2O2的对β-catenin、FoxO3a的作用，引起β-catenin和Tcf-4蛋白表达增加，FoxO3a蛋白表达下降（P＜0.05）。
　　[结论]：
　　1.高良姜提取物中F1、F4和F5可促进成骨细胞增殖、分化和矿化。F2、F3和F6未见明显的促成骨增殖、分化和矿化作用。高良姜提取物中F1、F4和F5均可对抗H2O2对成骨细胞增殖、分化和矿化的抑制作用。结果提示，高良姜各组分促成骨分化作用强弱可能与高良姜素含量多少有关。
　　2.高良姜提取物中F1、F4和F5能够抑制H2O2引起成骨细胞氧化应激及凋亡，可能与其调控FoxO3a通路有关。
　　3.高良姜提取物中F1、F4和F5可能是高良姜抗骨质疏松活性组分，其对抗H2O2引起的成骨细胞功能抑制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．2 研究目的

1．3 研究内容

2 高良姜提取物各组分中高良姜素含量的测定

2．1 研究目的

2．2 实验材料

2．3 方法与结果

2．4 讨论

3 大鼠原代成骨细胞体外培养及鉴定

3．1 研究目的

3．2 实验材料

3．3 方法与结果

3．2 讨论

4 高良姜提取物各组分F1~F6对体外培养的大鼠成骨细胞增殖和成骨分化的影响

4．1 研究目的

4．2 实验材料

4．3 方法与结果

4．4 讨论

5 H2O2对大鼠成骨细胞活力和成骨分化的影响及高良姜素活性组分的干预作用

5．1 研究目的

5．2 实验材料

5．3 方法与结果

5．4 讨论

6 H2O2对大鼠成骨细胞凋亡及高良姜活性组分的干预作用与机制研究

6．1 研究目的

6．2 实验材料

6．3 方法与结果

6．4 讨论

7 小结

参考文献

综述 PI3K／Akt信号通路在骨质疏松病理过程中的作用

致谢

附录

在读硕士期间的科研情况