SUMO蛋白酶Ulp1的固定化及其应用研究

摘要

SUMO融合表达系统广泛应用于实验室表达那些易于错误折叠、难溶或有毒性的蛋白，可以得到很好的表达效果。6*His是目前实验室最为广泛使用的融合标签之一，但是由于其分子量很小，容易被目的蛋白包裹，若将SUMO标签置于6*His与目的蛋白之间，可以很好的排除这种情况，使得挂柱效率大幅度提升。但是，某些分子量较小的蛋白由于大标签 SUMO的引入可能导致其功能丧失。SUMO蛋白酶 Ulp1可以很好的解决这个问题，通过识别 SUMO的三级结构，切割SUMO羧基端的GG-，从而得到目的蛋白，因此不会留下任何氨基酸残基，也不会影响对目的蛋白进一步的研究。但是商业化的 Ulp1价格昂贵，也有的实验室自己表达纯化 Ulp1，我们发现 Ulp1在经过反复冻融之后很容易失活，即使长期保存在-80℃冰箱中，也存在失活的情况，从而大大增加了纯化的人力与物力。本研究拟通过共价结合固定的方法，提高 Ulp1的稳定性，扩大它的应用范围。本文主要从以下几个方面展开研究工作：
　　（1）在前人的研究中我们了解到 Ulp1的活性位点是580位的半胱氨酸和514位的组氨酸，而赖氨酸残基并不在它的活性位点上，因为我们考虑通过赖氨酸残基或者是氨基末端将其固定在活性载体上。为此，我们制备了可靠的溴化氰活化的琼脂糖，醛基化的琼脂糖和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖，并检验了三种beads可以很好的用来交联蛋白。
　　（2）在溴化氰活化的琼脂糖，醛基化的琼脂糖和 N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖均可以有效的用来固定化蛋白前提下，我们对这三种beads固定化Ulp1蛋白做了研究，发现只有 N-羟基琥珀酰亚胺活化的琼脂糖可以在有效地共价结合Ulp1的同时不影响其活性，通过用 BSA做标样，BCA定量法和考马斯亮蓝法测定了固定化效率为1.68 mg/mL。
　　（3）对固定化Ulp1的酶学性质进行研究，结果表明：固定化Ulp1的pH适用范围广泛，可以从4.5-11.0，在11.0的时候，酶活略有减弱，和游离Ulp1基本相似。由于酶切体系是液体，固定化 Ulp1是固态，因此不利于混匀，为此在做切割速率试验时，加入了游离酶3倍酶量的固定化酶，结果表明它们的切割速率一致，所以在使用的时候为了提高切割效率，可以通过增加固定化酶的用量。在对于小分子耐受试验中，发现固定化和游离的Ulp1均可以耐受800 mM的氯化钠、1 M的尿素、100 mM的二硫苏糖醇、400 mM的咪唑，对于变性剂十二烷基硫酸钠均不耐受。此外检测了 Ulp1对有机试剂的耐受，发现20％的乙醇均不影响固定化和游离 Ulp1的活性，而15% DMSO会导致游离 Ulp1失活，但不影响固定化Ulp1的活性。
　　（4）对固定化Ulp1的稳定性研究，结果表明：固定化Ulp1在热稳定性上得到了显著的提高，在37℃处理24小时后，游离Ulp1已经完全失活，但是固定化Ulp1仍有97%的活性；而30℃处理72小时后，游离Ulp1已经完全失活，但并没有降低固定化Ulp1的活性；同样的25℃处理14天，固定化Ulp1仍有93%的活性，在4℃条件下保存50天，仍有活性。当用极端 pH去处理 Ulp1后，发现固定化Ulp1可以耐受4.5-10.5的极端pH处理，而Ulp1在pH10.5处理12个小时后已表现出活性丧失。通过对其重复使用次数探究，发现固定化 Ulp1在重复使用15次后仍保持90%的活性。
　　（5）为了进一步扩大固定化 Ulp1的使用范围，为此构建了快速纯化系统，可以在1个小时之内获得高纯度且没有标签的目的蛋白，若配合使用96孔板，可以同时纯化多种蛋白，为工业化奠定了基础。

目录

声明

第一章文献综述

1.1融合蛋白表达系统

1.2小泛素相关修饰物（Small Ubiquitin-Related Modifier）概述

1.2.1 SUMO化修饰

1.2.2 SUMO融合表达

1.3 Ulp1简介

1.4酶的固定化

1.4.1酶的固定化定义

1.4.2固定化酶的性质

1.4.3固定化酶的制备原则

1.4.4酶的固定化方法

1.5本课题研究的目的和意义

第二章固定化载体的制备

2.1前言

2.2材料和方法

2.2.1材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1 CNBr活化Sepharose交联效率

2.3.2醛基化的Sepharose交联效率

2.3.3 NHS活化的Sepharose交联效率

第三章Ulp1的固定化及其性质研究

3.1前言

3.2材料与方法

3.2.1实验材料

3.2.2实验试剂

3.2.3实验仪器

3.2.4试剂配方

3.2.5实验方法

3.3结果与分析

3.3.1 Ulp1的纯化

3.3.2 Ulp1的固定化

3.3.3 Ulp1的活性实验

3.3.4有机试剂的添加对于Ulp1活性的影响

3.3.5不同化学试剂对于Ulp1活性的影响

3.3.6 Ulp1的稳定性研究

3.3.7固定化Ulp1的重复利用

3.3.8快速纯化系统

3.4讨论

第四章结论

参考文献

附录

致谢

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