邻位开环双加氧酶TcID1介导朱砂叶螨对两种杀螨剂抗性研究

摘要

朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)在我国分布广泛，主要危害棉花、蔬菜等农作物。目前我国对于农业害螨的防治主要以化学防治为主，其中阿维菌素和甲氰菊酯是使用十分广泛的杀螨剂。这些杀螨剂的大量使用以及叶螨自身的生理特性，导致我国绝大多数地区的朱砂叶螨已经对阿维菌素和甲氰菊酯产生了抗药性。
　　邻位开环双加氧酶（Introdial ring-cleavage dioxygenases，ID-RCDs）是一类能够催化邻苯二酚类底物氧化分解的双加氧酶，主要存在于微生物如真菌、细菌中，其主要功能是降解带有芳香环的化合物。朱砂叶螨的基因芯片检测结果显示，相对于敏感品系（Susceptible strain，SS），ID-RCDs基因在阿维菌素抗性品系（Abametin resistant strain，AbR）和甲氰菊酯抗性品系（Fenpropathrinreisitant strain，FeR）中均上调表达。因此，本论文在此基础上，重点研究了ID-RCDs与朱砂叶螨对阿维菌素和甲氰菊酯抗性的关系并取得了以下研究结果：
　　1、朱砂叶螨ID-RCDs酶活性测定。
　　对朱砂叶螨ID-RCDs酶进行粗酶活性测定，该酶在AbR及FeR中的活性均显著高于SS品系，其中AbR品系酶活性是SS品系的1.63倍，FeR品系酶活性是SS品系的2.0倍。
　　2、朱砂叶螨TcID1基因克隆及序列分析。
　　基因克隆结果显示，朱砂叶螨TcID1基因全长的开放阅读框长度为774bp，编码257个氨基酸，蛋白分子量为29.4kD，等电点为5.31。经Signal IP4.1在线预测发现TcID1的翻译氨基酸含有23个氨基酸的信号肽，可能属于分泌蛋白。对朱砂叶螨TcID1氨基酸序列进行分析，发现TcID1编码的蛋白具有邻位开环双加氧酶特有的Fe3+结合位点：2个His和2个Tyr。与二斑叶螨、细菌、真菌等同源基因进行氨基酸序列相似性和进化分析，结果显示：朱砂叶螨TcID1基因与二斑叶螨基因tetur06g00460的相似度最高，氨基酸一致性为98％；与伊氏叶螨AFY99039.1氨基酸一致性为66%；而与真菌或细菌ID-RCDs相关的氨基酸一致性均低于40%。系统发育树结果显示，相对于细菌，朱砂叶螨TcID1基因与真菌类ID-RCDs具有更高的同源性。
　　3、TcID1基因在不同螨态、不同品系、药剂胁迫下的mRNA表达模式。
　　qPCR结果显示：在朱砂叶螨敏感品系的不同螨态中，TcID1基因在幼螨、若螨及3日龄雌成螨中均呈高表达，并且在若螨中表达量最高，其次为幼螨、成螨、卵；在不同品系之间，相对于敏感品系，AbR及FeR品系均呈高表达，这也验证了基因芯片中的相关结果；在阿维菌素（药剂在各品系中的LC30剂量）胁迫6h、12h及24h后，TcID1基因在SS品系表现为先增加后降低的表达模式；在AbR品系表现为先降低后增加的表达模式；甲氰菊酯胁迫6h、12h及24h后，TcID1基因的表达模式同阿维菌素胁迫结果类似。
　　4、RNAi鉴定TcID1基因在朱砂叶螨对杀螨剂抗性的功能。
　　采用叶碟法间接饲喂TcID1-dsRNA后，SS品系TcID1基因表达量下降60.7%，ID-RCDs酶活性降低38%，对阿维菌素的敏感性显著增加，表现为死亡率显著升高，分别为44%（阿维菌素LC30处理）和38%（阿维菌素LC50处理）；而对甲氰菊酯的敏感性无显著变化；饲喂TcID1-dsRNA后，AbR品系TcID1基因表达量下降67.5%，ID-RCDs酶活性降低44%，对阿维菌素的敏感性显著增加，表现为死亡率显著升高，分别为19.5%（阿维菌素LC30处理）和17%（阿维菌素LC50处理）；饲喂TcID1-dsRNA后，FeR品系 TcID1基因表达量下降47.7%，ID-RCDs酶活性降低40%，而对甲氰菊酯的敏感性无显著变化。
　　5、原核表达TcID1基因。
　　以pColdⅡ为表达载体，构建去除信号肽的TcID1重组表达质粒，并测序验证。将测序正确的重组质粒TcID1-pColdⅡ转化至大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测发现该基因一部分以可溶性表达，一部分以包涵体形式表达；经过镍亲和层析柱纯化，Western Blot检测表明TcID1基因在大肠杆菌中成功表达。以原儿茶酸为底物进行蛋白活性测定，结果显示重组蛋白比活力为0.1346±0.0090 nmol/μg.pro/min，Km为14.2±4.6 mM，Vmax为0.1163±0.0153 nmol/μg.pro/min。
　　6、TcID1异源表达产物与杀螨剂的作用模式。
　　药剂对重组蛋白酶活影响的测定结果显示，使用0.001mmol/L～2mmol/L的阿维菌素及甲氰菊酯均对重组蛋白酶活无影响；借助高效液相色谱检测TcID1重组蛋白对杀螨剂的代谢试验，结果表明TcID1重组蛋白不能代谢阿维菌素。

目录

缩略词

第一章 文献综述

1朱砂叶螨研究概况

2害虫害螨对阿维菌素的抗性机理

3害虫害螨对甲氰菊酯的抗性机理

4邻位开环双加氧酶

引言

第二章 朱砂叶螨邻位开环双加氧酶ID-RCDs活性研究

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三章 朱砂叶螨TcID1基因全长克隆及表达模式分析

第1节 朱砂叶螨TcID1基因全长克隆

第2节 朱砂叶螨TcID1基因mRNA表达模式研究

第四章 RNAi验证TcID1基因在叶螨抗性的功能

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第五章 朱砂叶螨TcID1基因原核表达及重组蛋白对阿维菌素的代谢研究

第1节 朱砂叶螨TcID1基因原核表达研究

第2节 TcID1重组蛋白生化特性研究

第3节 朱砂叶螨TcID1基因重组蛋白对阿维菌素的作用研究

第六章 结论与展望

参考文献

在读期间发表的文章

致谢