家蚕品系99R和CVDAR对BmNPV的抗性分析及病理学研究

摘要

家蚕作为驯化成功的寡食性经济昆虫已经有超过5000年的历史，养蚕业和蚕丝产业目前仍是许多发展中国家农业的重要组成部分。养蚕业每年能够为我国蚕农创造超过400亿的经济价值，但蚕病的发生却让蚕农蒙受巨大的经济损失。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是引起家蚕血液型脓病的病原，由于其发病快和难以控制等特点，目前仍没有防控该病的有效药物，故抗性育种将成为防控该病的有效方式。虽然数目众多的家蚕品种资源中部分家蚕品系具有抗BmNPV能力，但家蚕抗BmNPV作用机制仍不十分清楚。本研究利用对BmNPV具有抗性差异的家蚕品系99R、CVDAR和大造为材料，通过经口添食和体腔注射 BmNPV，鉴定它们对 BmNPV的抗性水平，并通过石蜡切片、HE染色和定量PC R等技术，观察了三种家蚕品系感染BmNPV后的病理学变化，分析了BmNPV在三种家蚕品系中的增殖复制差异，并对其抗BmNPV的机制进行了初步探索，以期为家蚕抗BmNPV研究提供基础依据。
　　本研究主要内容包括：⑴通过对三种不同品系家蚕4龄起蚕进行单头定量添食不同剂量的 BmNPV多角体病毒悬液，鉴定它们对 BmNPV的耐受性。感染后的生存曲线中大造死亡高峰集中在第4-6天，而99R与CVDAR死亡高峰集中在第6-8天，与对照组相比，死亡时间延后1-2天。大造的LD50为1.2×105多角体/头，99R的半致死剂量（LD50）为1.8×106多角体/头，CVDAR的 LD50为3.13×106多角体/头，两品系抗性水平相当且均高于对照。
　　同时我们通过体腔注射重组病毒BmNPVhsp-EGFP，检测了三种家蚕对BV病毒粒子的敏感性。生存曲线结果显示注射感染后大造在第3天出现死亡，死亡高峰在第4-5天，第7天全部死亡。99R和CVDAR在第5天出现死亡，之后死亡率保持在80%以上。注射感染后荧光观察，大造中出现强烈的绿色荧光信号，且荧光信号集中分布于脂肪体和气管周围；而99R和CVDAR品系未检测到荧光信号。两项实验结果表明，99R和CVDAR较大造对BmNPV呈显著抗性，可用于抗性差异品系间的病理学研究。⑵通过荧光定量PCR检测BmNPV感染家蚕中肠、血液和脂肪体组织后的病毒DNA复制水平变化情况。结果显示，在添食感染后24 h，大造中肠组织病毒DNA水平显著高于99R与CVDAR；血淋巴和脂肪体出现同样差异是在感染后48 h，随时间推移差异更为明显；99R与CVDAR只在96 h血淋巴中检测到差异，99R中病毒DNA含量高于CVDAR。结果表明在添食感染过程中中肠组织起到重要的防御作用。分别在注射感染后6 h、12 h和24 h，大造血液、脂肪体和中肠中病毒DNA含量增加且显著高于99R与CVDAR，并随时间推移差异逐渐扩大，呈两极分化趋势；在感染后，对应的三种组织在99R和CVDAR之间没有检测到显著且持续复制增殖现象。结果表明，家蚕品系99R和CVDAR的中肠、血液和脂肪体组织能够显著抑制病毒的复制增殖，这种现象在注射组体现的尤为明显。⑶基于添食过程中中肠的防御作用，将添食的三种家蚕四龄幼虫中肠组织进行石蜡切片和 HE染色观察比较。结果显示三者与对照组的中肠组织形态在感染后48 h无显著差异；感染后72 h，大造中肠细胞出现明显的细胞核膨胀增大现象，细胞核着色变浅，而99R与CVDAR无明显差异；感染后96 h，大造中肠细胞细胞质呈空泡状态，细胞核变大，且有脱落趋势，99R中肠细胞排列紊乱，细胞核有边排现象，且细胞内出现大量颗粒物质；CVDAR中肠部分细胞细胞核膨大，但排列整齐，部分细胞细胞质中出现大量的颗粒物质，这可能是其 BmNPV感染引起的特有变化，仍待进一步的分析。这些结果表明 BmNPV感染能够引起中肠的病理学变化，但发生时间较晚，暗示着中肠组织在 BmNPV感染初期并未受到显著的影响，能够保持正常的生理摄食消化功能；同时，大造和抗性品系的中肠对BmNPV的侵染存在差异，且两抗性品系的中肠受病毒的影响较小。⑷分别选取病毒转录四个时期基因各一个以及与病毒复制相关的8个基因，通过荧光定量PCR检测它们在不同品系的三个组织中的转录表达差异，期望利用病毒自身基因的转录水平变化情况来探究病毒在抗性品系各组织中的复制增殖差异。添食组中肠实验结果表示，在两抗性品系中肠中被检测的基因的转录在DN A第一轮复制期间未受到抑制。在注射组血液中，检测的四个时期基因的转录在DN A第一轮复制期间就被抑制，从而影响了 BmNPV的复制，且在病毒 DNA复制期间CVDAR血液中有三个病毒复制相关基因（me53、helicase和dnapol）的转录被抑制，99R血液中有四个病毒复制相关基因（me53、lef-1、lef-2和helicasel）的转录被抑制。注射组脂肪体中，四个时期主要基因中的ie-1、gp64和gp41基因的转录在DNA第一轮复制期间就被抑制，从而影响了BmNPV的复制，且在病毒DNA复制期间两抗性品系脂肪体中有三个病毒复制相关基因（me53、lef-1和lef-2）的转录被抑制。病毒基因的转录表达也暗示了99R与CVDAR品系之间的抗性抑制差异。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 昆虫杆状病毒研究进展

1.2 家蚕抗BmNPV研究进展

1.3 家蚕抗BmNPV品种选育

第二章 引 言

2.1 研究目的和意义

2.3 研究内容

2.4 技术路线

第三章 99R和CVDAR的抗性鉴定

3.1 材料与方法

3.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.4 小结与讨论

第四章 BmNPV在家蚕品系99R和CVDAR中的复制增殖及中肠组织病理学分析

4.1 材料与方法

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 小结与讨论

第五章 B mNP V基因在不同品系中的转录水平差异分析

5.1 材料与方法

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 小结与讨论

第六章 全文总结

论文创新点

参考文献

在读期间发表论文及参与课题

致谢