Geminin通过调控Fgf8和Notch信号协调Somite形成的分子机制研究

摘要

体节发生是脊椎动物（例如，斑马鱼）中重要的发育过程，这一过程中胚胎间叶前中胚层（PSM）的上皮细胞球囊周期性的形成成对的细胞，称为体节。“时钟和波峰模型”的提出阐述了体节形成的关键机制。这一模型提出由于在脊椎动物胚胎PSM区域的Fgf8的浓度梯度的波峰与分节时钟（振荡基因）的相互作用促使这一区域的前体细胞分化为潜在的体节细胞。当体节发生时，Fgf8维持前体节中胚层（PSM）细胞的预分化状态，他的限制性是体节形成的关键。Delta/Notch起始振荡基因在胚胎尾部芽体的表达，随后有节律地促使体节周期性的形成。然而在这一过程中是否存在一个重要的因子同时协调控制体节发生中的Fgf8和Notch信号，目前并没有文献报道。 Geminin是一个重要的细胞周期调控因子，在斑马鱼体节发生过程中geminin特异性地在胚胎的尾芽，PSM区域，以及新生成的体节中表达。而geminin的这种表达模式，让我们猜测它在体节发生过程中可能的起着某些作用。为了确定我们的假设，我们合成geminin MO去阻碍斑马鱼胚胎内源性geminin的翻译并下调geminin的功能。当geminin被敲降后，斑马鱼胚胎在原肠胚时期形成了较短的前后轴，而除此之外并没有其他的发育缺陷。当胚胎发育到早期体节形成时期，胚胎发育出现了延迟，细胞出现明显凋亡以及畸形的体节形态，并形成模糊不清的体节边界。 之前已经有文献报道称Fgf8在维持PSM区域细胞命运中起着重要的作用。其在PSM区域移植Fgf8球可以维持体轴尾部状态，并且促使发育形成更短的体节。RA与Fgf8被报道在小鼠体节同步构型和体节分节中，是通过两者浓度梯度拮抗来调控的。在这里，我们展示了当geminin功能被阻碍后，斑马鱼胚胎将会形成更为窄小的体节，而这都是因为在PSM和胚胎尾芽的Fgf8浓度梯度去抑制而导致的。 在许多物种中，Notch信号的缺失会导致体节发生的紊乱。在geminin MO的胚胎中，体节的边界将不能够合理的形成，而最终导致形成模糊的体节边界和沿前后轴体节极性的紊乱，但是在这一过程中震荡基因的表达却是正常的。在模式动物斑马鱼中，我们通过ChIP实验，荧光素酶报告实验，以及QPCR实验，揭示这些表型是因为geminin/Brg1复合物与mib1内含子3结合发生紊乱导致的。而在其体节发生过程中，后者之间互作并正向调控mib1的转录过程、Notch信号的活性，最终影响体节的分节过程。除此之外，我们还发现在斑马鱼中geminin同时也通过一种非依赖于mib1的方式调控deltaD的表达。 总而言之，我们的实验数据，首次解释了geminin在斑马鱼胚胎体节发育过程中的重要作用，geminin在这个过程中通过调控体节发生过程中的两个重要信号通路——Fgf8信号通路和Notch信号通路，从而对胚胎体节发育起到重要调控作用。一方面，通过注射geminin morphlino我们阻断了斑马鱼胚胎中内源性geminin的功能，deltaD和mib1的表达水平因此发生了下调，伴随着Notch信号的关键基因的下调，Notch信号的活性也发生了下调，进一步导致形成紊乱的体节边界或体节边缘的缺失的胚胎表型。而且我们同时还发现，geminin通过与转录因子Brg1形成复合物并且与mib1基因内含子3作用，从而正向调控mib1基因的转录过程，最终对体节发生过程起到调控作用。另一方面，斑马鱼胚胎中内源性geminin缺失功能的过程中，geminin通过直接或者间接的方式影响着胚胎体节发生过程中Fgf8和RA信号通路活性，其中胚胎体节处的fgf8的表达发生上调，而raldh2的表达发生下调，致使沿胚胎PSM区域到尾芽区域的Fgf8活性被抑制，最终形成沿前后轴方向变得相对与Con MO胚胎更为窄小的体节。最后我们得出结论，在斑马鱼胚胎体节发育过程中，geminin通过调控体节发生中的Fgf8信号和Notch信号通路的活性，从而参与协调体节分节和发生过程。

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摘 要

总而言之，我们的实验数据，首次解释了geminin在斑马鱼胚胎体节发育过程中的重要作用，geminin在这个过程中通过调控体节发生过程中的两个重要信号通路——Fgf8信号通路和Notch信号通路，从而对胚胎体节发育起到重要调控作用。一方面，通过注射geminin morphlino我们阻断了斑马鱼胚胎中内源性geminin的功能，deltaD和mib1的表达水平因此发生了下调，伴随着Notch信号的关键基因的下调，Notch信号的活性也发生了下调，进一步导致形成紊乱的体节边界或体节边缘的缺失的胚胎...

体节发生频率

Abstract

第1章 前言

1.1 体节研究背景和进展

1.1.1 体节发生的过程

1.1.2 体节发生的特点

1.2 体节发生的主要模型及主要分子机制

1.2.1体节发生的主要模型

1.2.1.1 clock and wavefront （时钟和波峰）模型

1.1.3体节发生的主要分子机制与信号通路

1.3 细胞周期因子Geminin在细胞周期和发育中的作用

1.3.1 细胞周期因子Geminin在细胞周期的作用

1.3.2 细胞周期因子Geminin在胚胎发育中的作用

1.4 模式动物斑马鱼在胚胎体节发育研究中的作用

第2章 材料和方法

2.1 实验动物斑马鱼及其饲养

2.2 试剂、耗材和仪器

2.3 培养基和有关主要试剂的配置

2.3.1 LB培养基的配制

2.3.2 实验所需各种缓冲试剂的配制

10×TBE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液的配制：

30×Danieau’s solution（PH 7.6）

2.3.3 western blot 相关溶液的配制

2.3.4 原位杂交相关溶液配制

2.3.5 cell death 杂交溶液的配制

2.3.6 Antibody staining （抗体显色）相关溶液的配制

PT: PBS + 0.3% Triton X-100；PBTN: PT + 4% BSA + 0.02% NaN3；PEM: 0.1 M PIPES, 1.0 mM MgSO4, 2 mM EGTA, pH adjust to 7 with NaOH；Fixative: PEM + 2-4% formaldehyde。

2.3.7 其他相关溶液配制

2.4 质粒和菌株

2.5 实验方法

2.5.1 斑马鱼total RNA的提取

2.5.2 反转录制备cDNA

2.5.4 重组质粒的构建

载体连接：

2.5.5 反义探针的制备

1）线性化质粒作为制备反义探针的模板

2）反义探针的合成

2.5.6 正义mRNA的合成与纯化

2.5.7 胚胎mRNA、MO注射和细胞移植

2.5.8 全胚胎原位杂交（Whole mount in situ hybridization）

2.5.9 整胚抗体显色反应（whole mount antibody staing）

2.5.10 细胞凋亡原位杂交

2.5.11 Western Blot

2.5.12 药物处理

2.5.13 胚胎热激实验

2.5.14 染色质免疫沉淀（ChIP）实验

2.5.15 荧光定量PCR

2.5.16 荧光素酶报告实验

2.5.17 显微镜拍照

2.6 实验数据统计及分析

第3章 细胞周期因子Geminin在斑马鱼体节形成和发育建成中的作用机制研究

3.1 引言

3.2 实验结果

3.2.1 Geminin参与了体节发生过程的调控

3.2.2 Geminin特异性的参与了体节发生过程的调控

3.3 讨论

同时为了排除实验中不同胚胎个体之间发育的差异，我们采用细胞单侧胚胎移植实验，在同一胚胎中的半侧胚胎中，移植注射有geminin MO的细胞和geminin MO ，p53 MO共注射的胚胎。在实验结果中展示，移植了细胞一侧的胚胎，相对于未进行细胞移植的一侧，出现明显的体节发育延迟和体节边缘紊乱的表型（图3.2.3 J）。同时，通过deltaD作为体节发育的指示蛋白（图3.2.3 G），展示出该指示标志蛋白，相对于未细胞移植的一侧，在geminin MO细胞移植的一侧的胚胎中deltaD表达出现下调...

3.4 总结

通过上述实验，geminin作为细胞周期蛋白，不仅仅参与了细胞周期的调控，还参与到胚胎早期发育的过程中，特别是在体节发育中起着重要地特异性地作用。当胚胎内源性geminin的功能发生下调和阻碍时，会明显导致体节发育发生紊乱，体节发育延迟，体节分节出现问题，同时导致体节发育形态不正常，以及体节边界模糊等一系列体节发育畸形的表型。通过geminin MO和p53 MO共注射实验以及geminin mRNA特异性回救实验，也进一步确定，这一系列体节发育异常的表型并非是由geminin功能阻碍导致...

第4章 Geminin 通过调控Fgf8和视黄酸（RA）的拮抗作用影响体节发生过程的作用机制研究

4.1引言

类似于神经发育的过程，F.Pituello’s 团队首先提出在体节发育中胚胎PSM区域的尾部的抑制子被激活，而在PSM尾部的抑制子已经被鉴定为FGF，他能够通过控制胚胎腹侧构型决定基因Pax6，来调控体节的发育（Bertrand N,2000）。

时钟和波峰模型是可以很好的解释胚体节发育模式的重要模型，该模型是由Pourquire 和他的合作研究者提出的(Dubrulle and Pourquié,2002;Dubrulle et al., 2001;Pourquié, 2004a)，这个模型指出体节的发生是由表达于PSM区域的分节时钟（振荡因子）和FGF8浓度的波峰效应共同作用，并通过激活存在于PSM头部区域的前体细胞逐步发育成潜在的体节。

视黄酸(RA)有报道称是体节发生的激活子。而视黄酸这样小的信号分子是由一种叫做RALDH2的酶消化产生的，而在体节发生时期该酶的表达在PSM的喙部和生成的体节上（Maden M,1998；Swindell EC,1999），但是这个酶在体节的尾部区域却是表达缺失。通过在体节PSM干细胞区域注射RA或者视黄酸的受体收缩剂将会诱导体节干细胞区域表达NeuroM,抑制RA信号通路，从而抑制体节向神经分化的能力（Diez del Corral R,2003）。同时在神经移植实验中，RA信号通路是腹部前体细...

在胚胎体节发育中，FGF信号表达的水平在这一过程中是十分重要的。当FGF在PSM区域的浓度下降到阈值之下，便定义了“波峰的决定”——而这一决定对于体节边缘和位置的确定至关重要（Dubrulle J，2001；Sawada A,2001）。体节发育过程中，维持FGF信号的高浓度将会阻碍体节分节发生，因而FGF信号的下调在胚胎发育分化中是及其重要的。尽管我们假设Fgf8的下调是由于原条尾部的运动促发的，极为重要的正是FGF信号的下调才决定了体节的发育过程，然而这一过程并非是单一的，而应该是由胚胎内很多...

在上一章中，我们通过geminin MO对胚胎内源性的Geminin进行敲降，发现注射了geminin MO胚胎的体节前后轴的长度变短，同时体节的尺寸也比野生型要小，那geminin是否参与了体节发生过程中Fgf信号的调控呢？在这一章中，我们通过原位杂交实验来检测在geminin MO的胚胎中，geminin与影响前后轴长度和体节尺寸大小的FGF信号通路有什么关键性关系。

4.2实验结果

4.2.1 Geminin特异性的参与调控体节大小，依靠RA－FGF8在体节发生中的浓度拮抗变化

Fgf8在维持胚胎PSM区域细胞命运的分化中，起着重要的作用（J. Dubrulle，2004；A. Sawada et al.,2001）。之前有科学家研究，将融合有Fgf8重组蛋白的珠子，移植到胚胎PSM尾部区域，该方法可以增加并维持该PSM区域Fgf8的浓度，由于Fgf8的高浓度一直维持将使体节尾轴保持并形成沿前后轴方向尺寸更短小的体节（J. Dubrulle,2001；A. Sawada et al.,2001）。

有不少文献报道，在体节同步模式和体节分节边界的形成中，RA和Fgf8的表达浓度梯度是相互拮抗的，而这个过程的调节正是由于两者之间位于胚胎前后轴中的浓度梯度的拮抗作用。（K. J. P. Griffin,1997；A. Mara, J，2007），我们通过药物抑制实验和转基因鱼阻碍实验的结果也展示了他们两者间的浓度拮抗关系（图4.2.2）。在这个实验中，我们构建了Fgf信号抑制的转基因鱼（Didier Y. R. Stainier Lab.馈赠）（Tg:hsp70: dnFGFR1-GFP），通过将...

因此我们猜想是否在geminin敲降后，对RA的表达也存在影响，从而证明geminin确实是通过影响RA和Fgf8在体节发育过程中前后轴不同位子表达的浓度拮抗作用，从而导致体节发育出现异常的。因此，我们也合成了RA信号通路基因raldh2的mRNA原位杂交探针，通过原位杂交实验检测raldh2基因在内源性geminin基因MO敲降的胚胎中的表达情况。我们首先收集10 体节时期的野生型胚胎，确定体节发育的这个阶段raldh2基因在体节的表达情况。在10体节时期raldh2是在心脏的前体区域（图4.2...

图4.2.3: Fgf8和RA信号通过geminin来调节体节合适的空间间距。（A-D）与Con MO 相比较（A,C）在geminin MO胚胎和geminin MO ，p53 MO共注射的胚胎中（n=28），86%的胚胎fgf8的表达都发生了上调。同时81%的胚胎（n=26）也都发生了raldh2基因的下调。（E）胚胎通过单边(左侧)注射Fgf8 mRNA和GFP mRNA 在胚胎左侧过表达Fgf8（n=5），在Fgf8过表达左侧的胚胎中，体节沿前后轴方向更短，实际上是单个体节沿前后轴方向形成...

Fig.4.2.3: Fgf8 and RA signaling mediate geminin to regulate proper somite space. (A-D) When compared with that in control (A, C) fgf8 expression was upregulated in geminin and p53 double morphants (B, 86%, n=28), but the expression of raldh2 was down...

4.3讨论

4.4结论

综合以上实验数据，说明体节发育的过程中，体节的分节是体节发育的关键过程而这个过程中起着重要作用的信号通路就是Fgf8信号通路，Fgf信号控制着体节发育中，新生体节的形成，在体节时钟和波峰模型中，波峰的形成中起着关键性的作用，控制着体节尺寸大小的形成（J. Dubrulle,2001；A. Sawada etal.,2001）。上一章中我们通过合成geminin的mophlino，注射斑马鱼野生型胚胎中，继而阻断内源性的geminin基因的表达，发现体节沿前后轴方向变短，相对于单个体节而言，...

第5章 Geminin 通过依赖于mib1的Notch信号通路途径和非依赖于mib1的Notch信号通路途径对体节发生调控的作用机制研究

5.1引言

5.2实验结果

5.2.1 内源性Geminin下调后Notch信号通路在介导体节发育中的作用

Mesp 家族基因是体节极性基因(Mitsuru Morimoto 2006; Atsushi Sawada 2000)。在小鼠体节发生过程中，体节发生对Mesp基因表达量的变化十分敏感(Mitsuru Morimoto 2006)。同时，在小鼠中，Mesp家族基因参与激活Notch信号通路上游基因，从而抑制Notch活性，最终导致体节边界位置的重排和前后轴中单个体节的形成的紊乱（M. Morimoto,2005；Y. Takahashi,2000）。斑马鱼中，Mesp/Mespaa对体节前后极性...

我们这些实验数据提出了一种geminin控制体节发生的假设，即geminin可能是通过控制Notch的活性来调控体节发生的过程和体节发育的前部极性状态。

5.2.2 Geminin调控体节发育时期胚胎mib1基因的表达

5.2.3 转录因子Brg1协助geminin与mib1基因内含子3相互结合从而调控转录因子mib1的转录

5.3讨论

5.3结论

第6章 总结

参考文献

致谢

博士在读期间发表论文及科研工作