KISS1/GPR54系统在山羊睾丸间质细胞自分泌的功能研究

摘要

KISS1（蛋白为Kisspeptin）及其G蛋白偶联受体54系统（G Protin-coupled Receptor54,GPR54）通过下丘脑-垂体-性腺轴对动物繁殖的重要调控作用。我们前期研究表明，KISS1基因作为免疫去势的新靶标免疫公羔后能够显著降低睾酮含量和阻滞睾丸发育，然而，仍不清楚其机制。激素类免疫主要通过抗体中和作用进而影响下丘脑-垂体中枢轴这个内分泌途径发挥作用。然而，KISS1在睾丸组织表达量较其它组织高，睾丸组织间质细胞产生和分泌的睾酮对睾丸发育发挥着至关重要的作用。因此，KISS1基因免疫除了通过内分泌途径发挥作用外，能否通过睾丸间质细胞自分泌途径达到去势的目的尚不明晰。本研究以大足黑山羊为研究对象，利用免疫组化、定量PCR、Western Blotting和酶免测定等技术，分析KISS1/GPR54在山羊睾丸间质细胞的表达，进一步分析Kisspeptin过表达处理对睾丸间质细胞Kisspeptin自分泌及功能的影响，阐明KISS基因免疫通过间质细胞自分泌途径去势的机制。本研究有望进一步提高KISS1基因疫苗免疫去势的效果，为激素免疫调控技术在动物上的广泛应用提供理论依据。本研究具体方法和结果如下： （1）KISS1及受体GPR54在山羊各组织的表达分布。采用qPCR技术检测山羊下丘脑、垂体、睾丸、附睾、胰脏、心、肝、脾、肺、胃、肾、十二指肠和淋巴结组织中KISS1及GPR54基因的mRNA含量，结果显示KISS1及GPR54在机体各组织广泛表达，KISS1在下丘脑、垂体、睾丸表达量较高，GPR54在下丘脑、垂体、胰脏和睾丸中表达量较高。 （2）Kisspeptin及受体GPR54在山羊睾丸间质细胞的表达。采用免疫组织化学方法检测Kisspeptin及GPR54在睾丸组织中的表达，结果显示山羊睾丸间质细胞和生精细胞中均存在Kisspeptin和GPR54蛋白的阳性表达；采用RT-PCR、Western Blotting检测KISS1和GPR54在分离培养的山羊睾丸间质细胞中的表达，结果显示KISS1和GPR54基因及它们的蛋白在间质细胞中均有阳性表达。 （3）Kisspeptin过表达处理对山羊睾丸间质细胞Kisspeptin自分泌的影响。采用100nmolKisspeptin、100nmolKisspeptin+100nmol peptin234和生理盐水来处理睾丸间质细胞，利用qPCR方法检测KISS1和GPR54基因表达含量，结果显示，Kisspeptin过表达处理能够使KISS1和GPR54的mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05），拮抗剂处理后，KISS1mRNA表达量与对照组差异不显著（P＞0.05），GPR54mRNA表达量仍显著高于对照组（P＜0.05）。研究结果表明，山羊睾丸间质细胞存在KISS1/GPR54系统自分泌作用。 （4）Kisspeptin过表达处理对山羊睾丸间质细胞Kisspeptin自分泌功能（即分泌睾酮）的影响。采用100nmolKisspeptin、100nmolKisspeptin+100nmol peptin234和生理盐水来处理睾丸间质细胞，利用ELISA法检测睾酮的分泌情况。结果显示，Kisspeptin过表达处理组的睾酮分泌量显著高于对照组（P＜0.05），加入拮抗剂后睾酮分泌量与对照组差异不显著（P＞0.05）。结果表明，Kisspeptin可通过自分泌方式促进睾丸间质细胞睾酮的分泌，提示KISS1基因免疫可通过对间质细胞自分泌方式的抑制作用达到去势的目的。

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