鼠精子抗原Sp17与IL-5融合蛋白的克隆表达及其免疫性避孕效研究

摘要

随着基因重组技术的发展和人们对生殖分子生物学的深入认识，免疫性避孕疫苗的研究是将来避孕节育研究的重要方向，免疫性避孕疫苗可能成为控制人口过度增长的理想措施。针对精子/睾丸抗原的免疫性避孕疫苗因可能适用于两性，而一直受到研究者的青睐。 本研究的主要结果及结论如下： 1.采用RT-PCR方法，从小鼠睾丸中扩增了编码精子蛋白Sp17的cDNA序列，通过定向克隆的方法将基因插入表达载体pET-28a(+)，构建了重组质粒pET/Sp17。再以质粒pGEM-1-IL-5为模板扩增小鼠IL-5基因片段，通过限制性内切酶定向克隆到pET/Sp17中，成功构建了重组质粒pET/IL-5-Sp17。 2.将重组质粒pET/Sp17和pET/IL-5-Sp17转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析显示：Sp17和IL-5-Sp17均获得表达，所获重组蛋白分子量分别约25kD、39kD大小，与预期的Sp17、IL-5-Sp17重组蛋白分子量理论值相近。用Ni2+-NTAAgarose亲和层析柱纯化后得到的重组蛋白Sp17和IL-5-Sp17的纯度分别约为88.9％和91％。Westernblot进一步证实了Sp17和IL-5-Sp17蛋白的表达。 3.融合蛋白IL-5-Sp17鼻内免疫小鼠后，检测其血清和生殖道特异抗体IgG和IgA滴度。各实验组小鼠于初次免疫后2周，血清及阴道冲洗液开始出现Sp17特异性抗体IgG及IgA反应，随后快速上升，多于初次免疫后6～8周达到峰值，抗体最高水平分别可达1：128000和1：1280，持续3周后略有下降。在初次免疫后4周开始，IL-5-Sp17、Sp17+IL-5组的特异性IgG及IgA抗体滴度均显著高于同期未使用佐剂的Sp17组(p＜0.01)。提示IL-5-Sp17蛋白疫苗鼻内免疫时可明显增强生殖道粘膜免疫反应，同时还可诱导系统免疫应答。 4.对免疫结束后10天之小鼠的脾脏淋巴细胞增殖率及淋巴细胞分泌的IL-4和INF-γ检测显示：IL-5-Sp17免疫后的小鼠脾脏淋巴细胞增殖率升高，淋巴细胞培养上清液中分泌的IL-4和INF-γ也升高，且以IL-4更明显。对IL-5-Sp17免疫后的小鼠血清亚型分析显示：IgG1高于IgG2a水平。表明IL-5-Sp17鼻内免疫诱导小鼠产生的免疫反应以Th2型为主，有利于机体的体液免疫应答。 5.鼻内免疫小鼠后，IL-5-Sp17、IL5+Sp17、Sp17组雌鼠的妊娠率分别降至15.4％、28.6％、57.1％，每胎产仔数分别降至4.88，5.0和4.75只，与对照组相比，均有显著下降。而且IL-5-Sp17组的妊娠率显著低于未使用佐剂的Sp17组。提示精子抗原Sp17在应用佐剂后均可产生不同程度的免疫性避孕效应，但均未能完全阻断所有雌鼠的生育力。 6.IL-5-Sp17免疫后小鼠的组织病理学观察未发现肝脏、脾脏、肾脏、肺、脑、卵巢及睾丸的明显结构改变。免疫后小鼠及其分娩的子代鼠的PCE/NCE和微核率与正常小鼠相比无明显差别。提示融合蛋白IL-5-Sp17鼻内免疫时具有良好的安全性。 7.IL-5作为精子抗原避孕疫苗鼻内免疫时的分子内佐剂，明显增强了避孕疫苗的阴道局部免疫反应和系统免疫反应，明显提高了避孕疫苗的避孕效果，为避孕疫苗的进一步研究提供了新思路和动物实验依据。

目录

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英文缩写一览表

前 言

第一部分鼠精子抗原Sp17的克隆及在原核系统中的表达和鉴定

第一节鼠精子抗原Sp17的克隆与重组表达载体的构建

实验材料

实验方法

实验结果

第二节鼠精子抗原Sp17在原核系统中的表达、纯化及鉴定

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第二部分鼠精子抗原Sp17与白介素-5融合蛋白的表达、纯化及鉴定

第一节鼠精子抗原Sp17与白介素-5融合基因的构建

实验材料

实验方法

实验结果

第二节鼠精子抗原Sp17与白介素-5融合蛋白的表达和纯化

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

第三部分鼠精子抗原Sp17与白介素-5融合蛋白在鼻内免疫中的免疫效应研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

第四部分鼠精子抗原Sp17与白介素-5融合蛋白在鼻内免疫中的避孕效应研究

实验材料

实验方法

结 果

讨论

全文结论

致 谢

照 片1

照 片2

参考文献

文献综述一避孕疫苗与粘膜免疫反应

一、粘膜免疫系统

二、粘膜免疫反应

三、影响粘膜免疫反应的因素

四、精子蛋白Sp17的研究概况

五、精子蛋白与粘膜免疫反应

六、构建粘膜疫苗的策略

六、结语

参考文献

文献综述二白介素-5的研究进展

1.概述

2.IL-5的分子结构

3.IL-5的生物学活性

4.IL-5的在器官移植中的作用

5.IL-5的免疫调节作用

6.IL-5在临床感染的研究进展

7.IL-5的粘膜免疫佐剂作用

8.结语

参考文献

在读期间发表的文章