咖啡酸苯乙酯对大肠癌细胞抑制作用及对β-catenin通路相关基因的影响

摘要

大肠癌是常见的恶性肿瘤之一,近年研究发现在绝大多数大肠癌中都存在β-catenin相关信号通路的改变.Β-catenin相关信号通路是细胞发育和生长调节的关键途径,其中β-catenin是该通路的中枢成分.由于抑癌基因APC的失活突变或癌基因β-catenin激活突变等因素都会引起该通路的异常,导致细胞内的β-catenin蛋白积累,与T细胞因子-4(T cell factor-4,Tcf-4)和其相关成分结合形成复合物,进入细胞核内,启动下游靶基因的异常转录,从而引起细胞异常增殖和肿瘤的发生.咖啡酸苯乙酯(caffeic acid phenethyl ester,CAPE)是一种酚类抗氧化剂,具有抗炎、抗病原微生物和抗肿瘤等作用.近年研究报道,CAPE作为蜂胶抗肿瘤作用的主要活性成分,对人白血病细胞和大肠癌等多种肿瘤细胞具有作用,可明显抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡.目前有关CAPE抗肿瘤作用的机理还不清楚,国外研究发现CAPE抗肿瘤作用可能与影响大肠癌异常的β-catenin相关信号通路有关.但这些影响发生在哪一个环节?是基因转录水平还是蛋白表达的改变?等问题都尚不清楚.目的:一、研究正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺瘤癌变和大肠癌组织中β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白的表达及临床意义,旨在进一步探讨β-catenin通路相关基因在大肠肿瘤发生、发展中的作用.二、探讨CAPE对体外培养的大肠癌细胞HCT116(表达野生型APC基因和突变型β-catenin基因)和SW480(表达野生型β-catenin基因和突变型APC基因)细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响.三、研究CAPE对大肠癌细胞β-catenin相关通路中β-catenin、c-myc和cyclinD1 基因转录和蛋白含量的作用,企图寻找其作用的靶点,初步阐明CAPE对大肠癌的作用及作用机理.方法:采用免疫组化法检测正常大肠黏膜、大肠腺瘤、大肠腺瘤癌变及大肠癌组织中β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白的表达.不同浓度CAPE处理体外培养的大肠癌HCT116和SW480细胞后,采用MTT法检测细胞的增殖活性;流式细胞仪检测细胞周期分布;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡率.采用免疫荧光染色观察CAPE作用后HCT116和SW480细胞内β-catenin表达位置的改变.逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)检测不同浓度CAPE作用24和48h后,对细胞β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA水平的影响.蛋白印迹法(Western blotting)检测β-catenin、cyclinD1和c-myc蛋白含量的变化.结果:一、正常大肠黏膜β-catenin蛋白表达定位于细胞膜,大肠腺瘤组织的β-catenin细胞浆和细胞核异位表达增加.大肠腺瘤癌变和大肠癌组织β-catenin细胞浆和细胞核表达明显增加,细胞膜表达有不同程度的减少.大肠腺瘤癌变组织β-catenin异位表达率为85.7﹪,大肠癌组织为63.1﹪,均显著高于大肠腺瘤(P<0.05).大肠腺瘤组织β-catenin细胞膜表达缺失率为31.3﹪,大肠腺瘤癌变组织为52.4﹪,大肠癌组织为70.8﹪.大肠癌组织细胞膜表达缺失率显著高于大肠腺瘤(P<0.01).大肠癌组织β-catenin的异位表达率与肿瘤分化程度、临床分期和淋巴结转移有关,低分化腺癌组显著高于高分化腺癌组(P<0.01),Dukes'C、D期显著高于A、B期(P<0.05),有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(P<0.05).正常大肠黏膜cyclinD1和c-myc均为阴性,大肠腺瘤和大肠癌组织中cyclinD1和c-myc主要呈细胞核表达,大肠癌组织cyclinD1和c-myc阳性表达率均显著高于大肠腺瘤(P<0.01).大肠癌组织中β-catenin异位表达率与cyclinD1和c-myc阳性表达率均呈明显正相关(r =0.31,P<0.05;r =0.49,P<0.01).二、随着CAPE浓度的增加和作用时间的延长,HCT116和SW480细胞的生长抑制率逐渐升高,抑制作用表现为剂量依赖性和时间依赖性.流式细胞仪细胞周期分析表明:2.5、5.0、10mg/L 的CAPE对HCT116 和SW480处理24h后,G<,0> /G<,1> 期细胞比例上升,S期细胞比例下降,细胞凋亡率也逐渐上升,呈剂量依赖性.同时发现CAPE作用后,细胞出现胞浆混浊,胞体缩小、变圆、皱缩,核固缩碎裂等凋亡形态学特征.三、免疫荧光染色检测发现经不同浓度的CAPE作用后,HCT116和SW480细胞细胞核和细胞浆内的β-catenin表达均有不同程度的减少,而细胞膜和细胞间连接处β-catenin表达明显增强.CAPE作用HCT116和SW480细胞后β-catenin mRNA和蛋白含量均有不同程度的下降,与对照组比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01).随着CAPE浓度的增高和作用时间的延长,β-catenin mRNA水平和蛋白含量逐渐下降,提示CAPE的作用呈剂量和时间依赖性.同时CAPE作用后,细胞c-myc和cyclin D1 mRNA转录和蛋白含量也有不同程度的下降,随着CAPE浓度的增加和作用时间的延长,c-myc和cyclin D1的下降水平也逐渐增高.结论:一、异常的β-catenin相关信号通路与大肠腺瘤癌变和大肠癌的发生发展有密切的关系,β-catenin异常表达可能是癌基因cyclinD1和c-myc激活的原因之一.Β-catenin的异常表达可以作为判断大肠腺瘤癌变和预测大肠癌患者侵袭转移及评估预后的良好指标.二、CAPE对大肠癌HCT116和SW480细胞株具有明显的增殖抑制作用,其作用机制与阻滞细胞周期G1期和诱导细胞凋亡有关.三、CAPE可以通过干扰β-catenin相关信号通路,促进β-catenin从细胞核向细胞膜易位,下调β-catenin及通路靶基因c-myc和cyclin D1等的转录和表达,从而抑制大肠癌细胞生长,诱导细胞凋亡.

目录

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论文正文

第一部分β-catenin通路相关基因在大肠肿瘤组织中的表达及其临床意义

第二部分咖啡酸苯乙酯对大肠癌细胞生长和凋亡作用的研究

第三部分咖啡酸苯乙酯对大肠癌细胞β-catenin通路相关基因的影响

文献综述一APC-β-catenin-Tcf-4信号通路与大肠癌

文献综述二咖啡酸苯乙酯抗肿瘤作用的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的论文