HBV感染抗原表位特异性CTL的研究

摘要

乙型肝炎病毒(HBV)感染仍为全球重要健康问题之一，大约有3亿5千万慢性感染人口，每年死于HBV感染的人数达1百万。 对HBV感染免疫发病机制的研究发现，HBV感染时抗原特异性CTL反应很弱，特别是慢性HBV感染，用传统检测抗原特异性CTL的方法，如有限稀释法(limitingdilutionassays，LDA)、5nCr释放试验法、酶联免疫斑点法等方法几乎检测不到，这种情况严重阻碍了HBV感染抗原特异性CTL的研究。自从1996年Altma1等发明了MHC-表位肽四聚体技术以来，四聚体技术已经广泛用于基础和临床研究，也推动了HBV感染抗原特异性CTL的研究。四聚体技术直接检测抗原特异性CTL，无需体外扩增，是一种高效敏感的方法。 本文用四种HBV抗原表位四聚体复合物，分别针对的抗原表位：FLPSDFFPSV(Tc18-27)、FLLTRILTI(Te183-191)、WLSLLVPFV(Te335-343)、FLLSLGIHL(Tp575-583)进行大量HBV感染病例抗原特异性CTL的研究，并对抗原特异性CTL在HBV感染发病机制中的作用进行了初步的探讨。主要研究结果如下： 1.HLA-A2-BSP融合蛋白和β-2微球蛋白的表达和纯化以及乙肝表位肽四聚体的构建。HLA-A2-BSP融合蛋白和β-2微球蛋白的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，转化细菌在IPTG的诱导下产生目的蛋白，用6×his融合蛋白纯化系统对表达蛋白进行纯化，将合成多肽、HLA-A2-BSP融合蛋白和β-2微球蛋白折叠复性、纯化，在生物素化缓冲液中进行复合体的生物素化，最后将生物素化复合体与PE标记的链亲和素混合，完成HBV抗原表位肽四聚体的构建。 2.建立四聚体复合物检测外周血抗原特异性CTL方法。6例HLA-A2阳性健康献血员和6例HLA-A2阴性HBV感染患者四聚体复合物阳性细胞占CD8+细胞的0～0.02％，而HLA-A2阳性HBV感染患者四聚体复合物阳性细胞占0～2.41％。将阴性的域值定为0.02％。 3.HBV感染者抗原特异性CTL的研究。对2例HBV感染自愈者、36例慢性HBV感染者、5例重型肝炎进行抗原特异性CTL数量的研究。发现自愈者四种抗原特异性CTL数量同时较高，大部分HBV感染患者外周血中抗原表位特异性CTL为阳性，但其数量一般较低，与ELISPOT和细胞内细胞因子染色检测抗原肽特异性CTL基本一致。慢性HBV感染个别患者则出现某一个抗原表位特异性CTL数量很高的现象，多出现在衣壳抗原183-191表位特异性CTL。在慢性HBV感染时，抗原表位特异性CTL与病毒载量及血清ALT无相关关系。重型肝炎与慢性HBV感染患者抗原特异性CTL数量无差别。 4.慢性乙型肝炎肝炎突发者抗原特异性CTL的研究。36例HBV感染患者按照血清转氨酶(ALT)水平分为4组，分别为ALT正常组ALT＜1×ULN(40U/L)，ALT升高2～5倍组(ALT≥2×ULN、＜5×ULN)，ALT升高5～10倍组(ALT≥5×ULN，＜10×ULN)，ALT升高大于10倍组(ALT≥10×ULN)。ALT升高5～10倍组多个抗原表位特异性CTL数高于其他组，统计分析有显著性差别(P＜0.05)。因此，ALT升高5～10倍组抗原特异性细胞免疫增强。 6例血清转氨酶(ALT)水平升高的HBV感染患者随访发现，3例随着ALT的下降，抗原特异性CTL降低，其中1例抗原特异性CTL的变化与ALT的变化基本一致。 结论1.完成了HLA-A2-乙肝表位肽四聚体的构建，为其他表位肽四聚体复合物的构建提供了技术保障。 2.四聚体技术对抗原表位特异性CTL的检测具有很强的特异性，HBV特异性HLA-A2四聚体复合物仅适用于HLA-A2阳性HBV感染的研究。 3.对急性和慢性HBV感染抗原特异性CTL水平存在明显差异，急性HBV感染抗原特异性细胞免疫反应强而且是针对多个抗原表位。慢性HBV感染抗原特异性细胞免疫反应弱，针对的抗原表位单一，抗原特异性细胞可能出现寡克隆增生。 4.慢性HBV感染抗原表位特异性CTL与病毒共存，抗原表位特异性CTL的存在并不代表机体具有保护性免疫。 5.肝炎突发时特异性细胞免疫增强，抗原表位特异性CTL与肝组织损伤有关。

目录

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摘要

前 言

第一部分可溶性HLA-A2肽四聚体复合物的构建

前 言

材料与方法

结 果

讨论

第二部分HBV感染外周血抗原表位特异性CTL的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨论

第三部分慢性HBV感染肝炎突发抗原表位特异性CTL研究

前 言

材料与方法

结 果

讨论

全文总结

不足与展望

致 谢

参考文献

文献综述一MHC-表位肽四聚体技术在病毒性肝炎研究中的应用

文献综述二慢性HBV感染肝炎突发的临床意义

研究生阶段发表论文