BMP4对SVZa神经干细胞增殖和分化的调控

摘要

本文在使用不同浓度BMP4细胞因子及其拮抗剂-Noggin诱导SVZa神经干细胞增殖、分化的基础上，利用启动子活体荧光标记技术，动态地显示BMP4在SVZa、RMS和OB(Olfactorybulb，OB)神经干细胞和祖细胞分化过程中的表达，同时使用Nestin增强子、酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)和GFAP启动子活体标记动态地显示SVZa神经干细胞的分化过程，结合原位杂交结果，探讨BMP4在SVZa神经干细胞增殖和分化过程中的作用。同时通过Mash1启动子活性分析探讨BMP4与Mash1转录因子的关系。主要结果如下： 1.原位杂交显示BMP4mRNA在新生小鼠的表达在SVZa到嗅球的迁移通路上，BMP4mRNA高表达于嗅球的周边细胞，而在嗅球的中心区表达较低。在SVZa区域，BMP4mRNA为中等量表达，细胞呈散在分布，在包绕SVZa的星形胶质细胞鞘中表达增高。在RMS中，BMP4mRNA的表达较为低下，仅见到极个别阳性细胞。此外，BMP4mRNA在与SVZa相邻的SVZp具有相当高的的表达。以上结果提示BMP4在SVZa神经干细胞发育不同部位发挥不同的生理作用。 2.BMP4启动子活性分析SVZa神经干细胞转染pDsRed-Bmp4pro质粒，贴壁分化12小时后见到极少量红色荧光细胞。24-48小时后SVZ神经干细胞培养孔中阳性细胞明显增多，荧光蛋白表达高峰期在48小时，48小时后减弱，5天后基本消失，早期(48小时内)红色荧光蛋白主要表达于神经元细胞，晚期则主要表达于星形胶质细胞。 SVZa、RMS和OB祖细胞分化过程中的荧光蛋白表达过程与SVZa神经干细胞相类似，但OB的阳性细胞明显较SVZa增多，且始终主要在神经元样细胞内表达，而RMS的阳性细胞较少。荧光分光光度计检测显示荧光强度由高到低依次为OB、SVZa和RMS。以上结果表明BMP4在SVZa神经干细胞迁移和分化的不同部位和不同时期存在差异表达，提示BMP4在SVZa神经干细胞发育的不同时期、不同部位发挥不同的生理作用。 3.BMP4对SVZa神经干细胞增殖的影响细胞计数结果显示在1、2、5ng/ml浓度时，BMP4促进神经干细胞的增殖，以2ng/ml浓度最明显；10、20、50、100ng/ml浓度时，BMP4抑制神经干细胞的增殖，浓度越高，抑制作用越明显。流式细胞仪周期分析结果表明，在1-5ng/ml浓度时，静止期细胞减少，DNA合成期细胞增加，仍以2ng/ml浓度明显；10-100ng/ml浓度时，静止期细胞大量增加，分裂期和S期细胞锐减。以上结果提示不同浓度的BMP4通过对细胞周期的调控影响SVZa神经干细胞的增殖，低浓度BMP4促进增殖，而高浓度BMP4则抑制其增殖。 4.BMP4对SVZa神经干细胞分化的影响加入不同浓度的BMP4，2天时行MAP-2和NSE免疫荧光染色，结果显示NSE阳性细胞均增多，流式细胞仪检测SVZa神经干细胞分化结果表明，1-100ng/ml浓度BMP4在2天时均可促进SVZa向神经元分化，1-10ng/ml时逐渐增加，10-100ng时处于一平台；在7天时行NSE免疫荧光染色，结果显示NSE阳性细胞均有所减少，流式细胞仪检测也得到相似的结果。加入10ng/ml浓度的BMP4，在不同时相点显示神经干细胞向神经元的分化，结果表明，BMP4在分化早期使神经元比例增高，2天时达到高峰，4天时与对照组持平，此后下降。以上结果提示BMP4对体外培养的SVZa神经干细胞具有双重作用，在干细胞分化的早期增加神经元分化比例，晚期则抑制神经元的分化。 5.Noggin对BMP4的拮抗作用转染PEGFP-Noggin质粒后加入不同浓度的BMP4，行NSE免疫荧光染色，结果显示Noggin能拮抗BMP4的作用，在早期使神经元数目减少，在晚期使神经元数目增多。流式细胞仪检测证实了免疫荧光染色结果。以上结果提示Noggin可佶抗BMP4的作用，在分化早期抑制神经元的分化，晚期促进神经元的分化。 6.BMP4影响SVZa神经干细胞分化的活体荧光标记SVZa神经干细胞转染Nestin-GFP质粒，贴壁分化8小时后即出现较多阳性细胞，24小时后达到高峰，此后减弱。加入10ng/mlBMP4后，阳性细胞大幅减少，在24-48小时内与对照组比较尤为明显，此后差异逐渐减小。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后1-3天内Nestin增强子活性明显减弱，而在4-7天内与对照组无统计学差异。转染TH-GFP质粒8小时后见到个别阳性细胞，此后逐渐增多，48-72小时达到高峰。加入10ng/mlBMP4后，TH阳性细胞有所增加，在24-48小时内与对照组比较有明显差异。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后在1、2和3天时与对照组存在差异，而在4天后无明显差异。 SVZa神经干细胞转染GFAP-GFP质粒，贴壁分化8小时后见到阳性细胞，此后逐渐增多。加入10ng/mlBMP4后，阳性细胞均有所增加。与Nestin-GFP和TH-GFP标记不同的是，GFAP启动子活性在观察期内持续增多。荧光分光光度计定量检测结果显示，加入BMP4后GFAP启动子活性在观察期内(1-7天)持续增多，均有统计学差异。以上结果表明在分化的早期，BMP4使神经干细胞标志物(Nestin)的表达减少，多巴胺神经元(TH)的标志物增多，即神经前体细胞减少，而成熟神经元增多，而在晚期却没有统计学差异，这显示BMP4只是加速了神经干细胞和组细胞的分化，并没有特异性地诱导SVZa神经干细胞向神经元分化。 7.BMP4对Mash1启动子活性的影响SVZa神经干细胞转染Mash1-LacZ质粒，贴壁分化后1天行X-gal染色即出现一些阳性细胞，主要在细胞核内出现，结合相差显微镜观察发现大多为神经元样细胞着色。加入10ng/ml的BMP4，在分化后1-2天内阳性细胞数有所增加，此后阳性细胞数增加不明显，4天后则有所减少。细胞计数结果表明，加入BMP4后在分化的早期增强Mash1启动子活性，1天和2天时与对照组存在统计学差异，在晚期有减弱Mash1启动子活性的趋势，但与对照组比较差异不显著。以上结果提示BMP4在SVZa神经干细胞分化的早期诱导了Mash1转录因子的产生。 通过对以上结果的综合分析，结合参考文献，本研究尚得出以下结论：1.本研究中采用的启动子活体荧光标记实现了BMP4表达的活体追踪，能够反映正常情况下内在蛋白的表达情况，而且动态地显示了神经干细胞向多巴胺能神经元和星形胶质细胞的分化过程，显示其为一种较好的活体追踪方法。 2.BMP4启动子活性分析显示，在分化的晚期红色荧光蛋白主要在胶质细胞内表达，流式细胞仪检测在7天时发现BMP4抑制神经元的分化，而启动子活性分析显示BMP4持续性增加GFAP启动子活性，因此BMP4本身对SVZa神经干细胞的特异性作用可能仍然为抑制神经元的分化，促使其向星形胶质细胞分化。 3.在嗅球周边区域，原位杂交和启动子活性分析显示BMP4为高表达，体外培养显示高浓度的BMP4抑制干细胞的增殖，促使其退出细胞周期而分化，由于在嗅球主要为已定向的神经元祖细胞，因此BMP4在嗅球周边区域的主要作用可能是促使祖细胞退出细胞周期启动祖细胞的分化。 4.在RMS和嗅球中央区，原位杂交和启动子活性分析显示BMP4的表达量低，而低浓度的BMP4促进祖细胞的增殖，不断进入细胞周期，因此在此部位，BMP4的作用可能为促进其增殖，维持神经元祖细胞状态而不使其继续分化。5.在SVZa，原位杂交和启动子活性分析显示为中等量的表达，因此BMP4在SVZa可能具有更为复杂的作用，它既可促进神经干细胞向星形胶质细胞分化，还可能具有促进干细胞退出细胞周期的作用。在SVZp，原位杂交显示为高丰度的BMP4mRNA，表明其可能主要促进神经干细胞向星形胶质细胞分化。 6.BMP4在SVZa神经干细胞分化的早期通过诱导Mash1转录因子的产生参与神经元的分化。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明和版权使用授权书

常用英文缩写一览表

前 言

材料和方法

结 果

一、质粒酶切鉴定结果

二、SVZa神经干细胞培养

三.BMP4在新生小鼠SVZa、RMS和OB区域细胞的表达

四、BMP4对SVZa神经干细胞增殖的影响

五.BMP4对SVZa神经干细胞分化的影响

六、Noggin对BMP4的拮抗作用

七、BMP4影响SVZa神经干细胞分化的活体荧光标记

八、BMP4对Mash1启动子活性的影响

讨 论

结 论

致谢

参考文献

文献综述一SVZ干细胞和祖细胞

一、SVZ干细胞和祖细胞概述

二、SVZ细胞构筑

三、SVZ干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化机制

四、SVZ神经干细胞在中枢功能重建中潜力

参考文献

文献综述二BMP在CNS发育中的作用

学习期间发表的论文

SVZa neural stem cells differentiate into distinct lineages in response to BMP4

Antisense Noggin oligodeosynucleotide administration decreases cell proliferation in the dentate gyrus of adult rats

A modified method for generation of neural precursor cells from cultured mouse embryonic stem cells