胃饲乙醇预处理增强肝脏对缺血再灌注损伤耐受性的实验研究

摘要

本研究的目的在于在以往研究的基础上进一步探讨通过胃饲乙醇预处理能否延长大鼠肝脏耐受入肝血流阻断的安全时限。 以门静脉转流下的肝脏缺血再灌流模型为基础，并采用前期实验已建立的胃饲乙醇预处理方法：术前24h给予大鼠胃饲40％乙醇5g/Kg。健康成年Wistar大鼠，雌雄不限，随机分为：肝脏缺血手术组(IR)和胃饲乙醇预处理组(EPC)。胃饲40％乙醇5g/Kg24h后行肝脏缺血手术，肝门阻断时间为120min。阻断期间观察肝脏缺血情况、胃肠道淤血情况。观察动物存活时间为2周。如果20只大鼠中在观察时间内出现1只以上死亡，则将缺血时间缩短至110min，继续观察存活情况，如动物仍有死亡则将缺血时间继续减少至100min；如果大鼠无死亡，则缺血时间可继续延长，直至动物出现死亡。以动物存活率为100％的入肝血流阻断时间初步设定为最大安全时限。 结果发现,胃饲乙醇后，动物中毒症状轻微，很快完全恢复；术中肝门阻断后，胃肠道无明显淤血;肝脏缺血120min后，EPC组术后2周内无动物死亡，存活率为100％；IR组术后2周内存活率为70％;阻断肝脏血流时间延长后，各组死亡数增高。肝脏缺血130min后，EPC组术后2周内动物存活率为80％，IR组术后2周内存活率为60％;与EPC缺血120组相比，IR缺血120min组、EPC缺血130min及IR缺血130min组死亡率均明显增高，差异具有显著性意义(p＜0.01)。根据此结果，可将大鼠入肝血流阻断的最大安全时限初步设定为120min，进一步验证。 实验提示，经胃饲乙醇预处理后可能延长大鼠肝脏对缺血耐受的最大安全时限至120min。 本实验以胃饲乙醇预处理模式为处理因素，探讨其对120min缺血时肝脏的保护作用，以进一步证明该预处理后大鼠肝脏耐受缺血的最大安全时限可延长至120min。实验分为：正常对照组(N)、胃饲乙醇组(E组)、肝脏缺血手术组(IR组)、生理盐水预处理组(NPC组)、胃饲乙醇预处理组(EPC组)和缺血预处理组(IPC组)。于再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h及1w活杀动物，留取下腔静脉血以及右肝前叶组织，以存活率、肝功能、肝组织ATP含量、肝细胞凋亡及病理形态学为观察指标。 结果发现,术中动物麻醉平稳，胃肠道未见明显淤血。术后EPC组恢复平稳顺利，24h后能自由饮食及活动；IPC组、NPC组及IR组在术后动物全身状况较差，36h后方能自由活动。EPC组动物术后1w内存活率为100％，IPC组存活率为78％，IR组存活率为78％，NPC组存活率为83％，EPC组与其余各手术组术后存活率相比差异显著(p＜0.05);E组ALT于相应各个检测时相与正常组对照无显著差异(p＞0.05)，各手术组于再灌流72h后ALT值与正常组相比无明显差异(p＞0.05)，EPC组再灌流6h、24h显著低于NPC组(p＜0.05)，再灌流0h、6h显著低于IR组(p＜0.05)，与IPC组相比无明显差异(P＞0.05)，但各时相的ALT值均低于IPC组；NPC组与IR组再灌流后ALT变化规律相近，在各个时相无显著差异(P＞0.05);E组AST值于相应各个检测时相与正常组无显著差异(p＞0.05)；各手术组AST值均显著高于正常组(p＜0.01)，于再灌流72h后AST值与正常组相比无明显差异(p＞0.05)；EPC组各时相的AST值与IR组、NPC组及IPC组相比无明显差异(p＞0.05);各组动物肝组织ATP含量比较：E组、EPC组于再灌流12h后逐渐恢复，与正常组无显著差异(P＞0.05)；其余各手术组动物于再灌流72h后逐渐恢复正常；IR组和EPC组无显著差异(P＞0.05)，但各时相IR组的ATP值均低于EPC组；NPC组再灌流12h、IPC组再灌流24h的ATP值明显低于EPC组相应时相点的ATP值(p＜0.05);肝组织病理观察：IR组和NPC组可见肝窦内淤血及广泛肝细胞变性及大量坏死，汇管区炎症细胞聚集，部分肝小叶正常结构破坏；而EPC组、IPC组明显较前两者病理损害轻，可见肝细胞浊肿变性，散在肝细胞坏死，肝小叶结构完整，未见明显组织结构破坏。根据肝脏再灌流24h各组病理分级，EPC组明显优于IR及NPC组;Tunel染色法检测各手术组术后肝细胞凋亡情况，结果发现：EPC组肝细胞凋亡数目于再灌流24h、72h显著少于IPC组，于再灌注1w低于IR组及NPC组；IR组与NPC组各时相点无明显差异，两组于再灌注12h、24h未发现典型的凋亡细胞，显微镜观察发现这两个时相点IR组与NPC组肝细胞发生大面积坏死，汇管区中性粒细胞浸润。提示胃饲乙醇预处理对肝脏120min缺血再灌流损伤具有明显的保护作用。 采用免疫组织化学方法观测胃饲乙醇以及乙醇预处理对缺血再灌流后肝脏HO-1表达的影响，研究HO-1与肝脏缺血再灌注耐受性的关系，初步研究胃饲乙醇预处理对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的分子机制。在正常大鼠肝组织内仅Kupffer细胞有微弱表达，肝细胞内未发现阳性表达;胃饲乙醇可以诱导HO-1的生成，乙醇胃饲后24hHO-1达到高峰，逐渐减弱，48h后几乎无阳性表达;胃饲乙醇预处理对120min缺血再灌注损伤肝脏HO-1表达的影响：EPC组HO-1于再灌注0h即有阳性表达，随时相延长表达逐渐增强，6h明显增强，持续至12h达到最强，24h后逐渐减弱，至1w仍有弱阳性表达。每一时相点比较，EPC组HO-1阳性表达均显著高于其余各组，随时相延长相差明显。HO-1增强表达与胃饲乙醇预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用相一致，提示胃饲乙醇预处理对肝脏缺血-再灌注具有一定的保护作用，而HO-1可能是其保护作用的物质基础之一。 结论:适当剂量浓度范围的乙醇胃饲是一种安全有效的预处理模式，40％乙醇5g/kg胃饲后24h行肝脏缺血手术可以增强肝脏对缺血再灌注损伤的耐受性，经该预处理可以延长大鼠肝脏耐受缺血的最大安全时限至120min。 胃饲乙醇预处理在肝脏缺血120min时，可以明显增强肝脏对缺血再灌注损伤的耐受性，有效减少肝细胞的坏死和凋亡，更大程度地保留肝组织ATP含量，有效抑制肝脏ALT的释放，从形态结构及肝细胞功能上发挥保护作用。 胃饲乙醇预处理可以有效增强肝脏缺血再灌注损伤后HO-1的表达，HO-1的增高表达与胃饲乙醇预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用相一致，提示HO-1可能是胃饲乙醇预处理增强肝脏对缺血再灌注损伤耐受性的分子基础之一。

目录

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英文缩写一览表

摘要

前 言

第一部分大鼠耐受入肝血流阻断的最大安全时限的初步确立

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分胃饲乙醇预处理对大鼠肝脏缺血再灌流损害的保护作用

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第三部分胃饲乙醇预处理对肝脏缺血再灌流后HO-1表达的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

照 片(一)

照 片(二)

照 片(三)

照 片(四)

参考文献

文献综述血红素氧合酶的研究进展

参考文献

研究生期间发表论文