人牙髓干细胞体外三维培养扩增的实验研究

摘要

背景及目的: 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞，根据其来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(embryonicstemcellsESC)的研究由于受到伦理道德、种族观念的约束和潜在异体排斥反应的影响，其应用前景不是十分乐观。成体干细胞(adultstemcellsASC)因具有来源广泛、可塑性强、无排斥反应等优势已成为近年来研究的热点之一。目前已经在机体几乎所有组织中发现了成体干细胞，其中包括骨髓、软骨、血液、血管、神经、肌肉、脂肪、皮肤、角膜、肠、肝脏以及胰腺等。 牙髓干细胞(dentalpulpstemcellsDPSCs)作为成体干细胞中较年轻的一员，于2000年首次由Gronthos等提出。他们把通过酶分离具有克隆形成能力的、高增殖率的人牙髓细胞命名为DPSCs。以后许多学者陆续发现人脱落的乳牙、猪、小鼠、大鼠等的牙髓中也有DPSCs的存在，并对其特性、定位、体外扩增进行了研究。DPSCs的发现，为牙髓损伤及修复机制的研究提供了一个新的平台，更为重要的是，为牙齿组织工程学带来了突破性进展。 许多学者对DPSCs的特性、定位及扩增进行了研究，但常规二维(2-dimention2D)培养费时、缓慢、占用空间较大、容易污染，已经影响了牙齿组织工程种子细胞的大规模扩增。近年发展起来的旋转细胞培养系统(rotarycellculturesystemRCCS)和微载体(microcarrier)相结合的三维(3-dimention3D)培养方法，已广泛地应用于贴壁细胞的培养和扩增，为组织工程种子细胞的大规模扩增提供了可能。 微重力组织工程(microgravitytissueengineering)是近年来由美国空间生物技术研究人员开创的一个独特研究领域，其核心技术是利用转壁式生物反应器(rotatingwallvesselbioreactorRWVB)形成的模拟微重力(simulatedmicrogravity)环境，进行动物细胞的三维培养。旋转细胞培养系统又称转壁式生物反应器，利用RCCS进行动物细胞三维培养时，由于旋转过程中正常的重力向量持续随即化，使细胞处于一种模拟自由落体状态，在一定程度上类似于微重力环境，因此称之为模拟微重力。 本研究在对人DPSCs进行分离、培养和鉴定的基础上，利用微载体在RCCS中进行三维培养，对其在体外的大规模扩增的可行性进行初步探讨。 方法: 1.在我科以往研究的基础上，参考并改进Gronthos等的方法，从成人健康的第二前磨牙中获取牙髓，用酶消化法和酶解组织块法进行原代DPSCs培养并常规传代。人DPSCs的鉴定从以下三方面进行：(1)细胞克隆形成率(colonyformingunit-fibroblastCFU-F)；(2)细胞免疫表型：免疫组化和RT-PCR检测细胞vimentin(间充质细胞标志)、CD44(未分化间充质细胞标志)、nestin(神经嵴来源细胞标志)、desmin(肌细胞标志)、DSP(成牙本质细胞标志)、osteocalcin(钙化组织标志)的表达；(3)细胞的多向分化潜能：肌细胞诱导和成牙本质细胞诱导。 2.人DPSCs的三维培养：将处理好的0.25gCytodex3微载体与50ml含1×105/mi第4代DPSCs的新鲜DMEM/F12(含15％FBS)混合均匀，装入经高压灭菌的HARV中，此时，培养基充满整个容器，无气泡，调整转速，使微载体不与器壁碰撞，不在中心聚集。整个装置放入37℃、5％CO2的培养箱中。常规换液。三维培养后，免疫组化检测vimentin、CD44、GFAP、desmin和DSP的表达。 描绘细胞生长曲线：(1)二维培养：第4代DPSCs以1×105/mi的密度接种于24孔板中，每孔1ml，常规换液。培养基为DMEM/F12(含15％FBS)。每天将3孔细胞消化，台盼蓝染色，用血细胞计数板计数活细胞数，取其平均数；(2)三维培养：每天在旋转状态下取样0.3ml。其中0.1ml用于细胞计数，样品沉淀，弃上清，沉淀中加入等量0.1％结晶紫(0.1mol/L柠檬酸)溶液，置37℃，30min后反复吹打，计数细胞核，即为活细胞数。其余用于倒置显微镜下形态学观察。 结果: 1.酶消化法原代培养的DPSCs，贴壁慢，生长慢，48h后呈克隆样生长，多数细胞为长梭形的成纤维细胞样细胞，少数为多角形、纺锤状或椭圆形，90％汇合时常规传代。酶解组织块法原代培养的牙髓细胞为长梭形的成纤维细胞样细胞，呈放射状排列。2.酶消化法和酶解组织块法培养的DPSCs的CFU-F分别为41克隆/104细胞和8克隆/104细胞。细胞免疫表型检测结果：vimentin、CD44、GFAP、nestin、osteocalcin阳性，desmin、DSP阴性。 3.DPSCs经成肌分化诱导，部分细胞胞体明显增大，约23d左右，有粗杆状的肌管样细胞形成，免疫组化检测有desmin的表达。 矿化液连续培养26d，DPSCs呈复层生长，形成细胞结节，并钙化，茜素红染色阳性，抗DSP阳性。 4.在三维空间培养，接种24h后，细胞大部分贴附于微载体表面，呈半球形，至第9d，长满微载体表面。三维培养后免疫组化检测vimentin、CD44、GFAP、desmin和DSP的表达，和培养前一致。 在二维及三维空间培养描绘的细胞生长曲线图，统计学分析结果表明，两者之间存在显著差异(P＜0.05)。 结论: 1.从成人健康的第二前磨牙牙髓分离到了具有克隆形成能力的DPSCs，经定向诱导，可分化为肌细胞和成牙本质细胞，具有干细胞的特性。 2.采用Cytodex3微载体和RCCS相结合的三维培养方法可以实现DPSCs的体外大规模扩增。

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摘要

前言

第一部分人牙髓干细胞的分离、培养和鉴定

第二部分人牙髓干细胞的体外三维培养扩增

全文总结

致谢

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参考文献

文献综述一牙髓干细胞研究进展

文献综述二细胞培养系统研究进展

研究生期间发表的主要论文