端粒植入和端粒位置效应对胃癌细胞生物学行为的影响

摘要

胃癌的发生是一个由多基因改变、多种因素参与、并经历了多步骤的渐进过程，癌基因，抑癌基因、DNA错配修复基因、细胞黏附分子、端粒/端粒酶、细胞周期调节因子和生长因子/受体系统等多个基因改变的积累参与了由正常上皮细胞转变成胃癌的过程。为深入探讨端粒改变在胃癌发生中的作用，本实验拟将外源端粒片段植入胃癌细胞，观察外源端粒植入和端粒位置效应对细胞生物学活性的影响，同时观察对端粒长度和端粒酶活性、细胞周期调控相关基因表达及P16和错配修复基因hMLH1甲基化状态的影响，希图进一步阐明染色体端粒结构和功能异常在胃癌发生发展中的作用，从全新的角度揭示胃癌的发生机理。 一、目的：拟对端粒植入和端粒位置效应对胃癌细胞生物学行为、端粒长度，端粒酶活性、细胞生长相关基因表达、P16和错配修复基因hMLH1甲基化状态的影响进行观察，希图进一步阐明染色体端粒结构和功能异常在胃癌发生发展中的作用，从全新的角度揭示胃癌的发生机理。 二、方法：1)采用新一代聚阳离子脂质体LipofectAMINTM2000作为载体，首先将绿色荧光蛋白质粒转染入人胃癌细胞SGC7901内，，证实转染成功且转染效率较高后，将含有端粒片段质粒pSX-T2AG3-neo及空载体质粒转染入人胃癌细胞SGC7901内，进一步经G418筛选形成细胞克隆，采用PCR在基因水平鉴定外源性端粒片段在细胞内植入；2)采用TRAP法检测转染细胞端粒酶活性变化；3)采用TRF法检测转染细胞端粒长度变化；4)采用MTT法检测细胞生长曲线；5)采用流式细胞仪测定细胞周期；6)采用Westernblot测定p53、p21、caspase-3表达变化；7)从光镜水平观察转染细胞形态学改变；8)通过染色体核型分析细胞染色体变化；9)通过Westernblot，RT-PCR测定hTERT表达变化；10)采用RT-PCR测定P21、caspase-3mRNA表达变化；11)采用甲基化特异PCR测定P16，MLH1基因启动子区域甲基化变化；12)将pTet-off调节质粒和携带荧光素酶报道基因的pTRE2-Hyg-Luciferase反应质粒共转染胃癌细胞SGC7901，经强力霉素(deoxycyline)诱导24h后检测报道基因活性，观察强力霉素诱导的抑制反应。然后将插入有端粒片段的荧光素酶报道质粒pBX和对照质粒pBX-ntf(noteloemerefragment)分别与pTet-off调节质粒共转染细胞，在强力霉素诱导下，检测报道基因活性的改变。 三、结果1)通过脂质体法，将含有端粒片段质粒pSX-T2AG3-neo及空载体转染入人胃癌细胞SGC7901内，进一步经G418筛选，获得细胞阳性克隆，分别命名为7901-telo和7901-neo细胞，并采用PCR在基因水平证明外源性端粒片段在细胞内可以稳定植入；2)与7901-neo及7901细胞相比，7901-telo(246.33±4.73，253±2vs200±2.08，P＜0.05)细胞端粒酶活性明显降低，端粒长度延长不明显；3)与7901细胞和7901-neo细胞相比较，7901-telo细胞增殖速度减慢；流式细胞仪测定细胞周期发现，7901-telo细胞G0/G1期细胞增加，S期细胞明显减少，G2M期细胞增加，增殖指数减少，转染空载体的7901-neo细胞与7901细胞相比细胞周期变化不大；4)与SGC7901细胞和SGC7901-neo细胞相比，SGC7901-telo细胞p53蛋白表达降低(0.59±0.01vs0.68±0.00，0.69±0.01，P＜0.05，)，p21蛋白表达升高(0.95±0.026vs0.73±0.04，0.68±0.05，P＜0.05)，caspase-3蛋白表达改变不明显(0.60±0.01，0.60±0.02vs0.60±0.01，P＞0.05)；5)核型分析显示SGC7901，7901-neo，7901-telo细胞染色体数目为65-68条不等；6)hTERT蛋白在7901-telo细胞表达比在7901-neo细胞和7901细胞中表达降低，(0.73±0.00vs0.95±0.04，0.95±0.02，P＜0.05)，在7901-neo细胞和7901细胞中的表达无显著差异(P＞0.05)；hTERTmRNA表达水平在7901-telo细胞表达显著低于7901-neo细胞和7901细胞(0.56±0.01vs0.76±0.02，0.78±0.03，P＜0.05)，在7901-neo细胞和7901细胞中的表达无显著差异(P＞0.05)；7)SGC7901-telo细胞中P21mRNA表达明显高于SGC7901细胞和SGC7901-neo细胞(0.99±0.01vs0.91±0.01，0.90±0.02，P＜0.05)，但在SGC7901细胞P21mRNA表达与SGC7901-neo细胞相比差异不显著(P＞0.05)，caspase-3在各组细胞的表达无显著差异(0.94±0.01vs0.94±0.01，0.94±0.01，P＞0.05)；8)7901-telo细胞中p16基因启动子区域DNA甲基化水平显著低于SGC7901细胞和SGC7901-neo细胞；9)7901-telo细胞中hMLH1基因启动子区域甲基化水平与SGC7901细胞和SGC7901-neo细胞相比无显著差异。10)基转染pTet-off和pTRE-Hyg-Luciferase质粒的SGC7901细胞，在强力霉素作用下荧光素酶报道基因的活性逐渐降低。强力霉素诱导分别共转染有pTet-off和pBX质粒或pTet-off和pBX-ntf的细胞时，前者荧光素酶活性较后者降低4倍。 四、结论本研究成功将携带了1600kb端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSX-T2AG3-neo稳定转染至人胃癌7901细胞中，证明端粒植入可降低细胞端粒酶的活性和端粒酶活性亚单位hTERT的表达，使P21蛋白表达上调和突变型p53蛋白表达下调，p16基因启动子区域甲基化水平降低，细胞增殖减慢，但对端粒长度、hMLH1基因启动子区域甲基化水平和caspase-3mRNA表达无明显影响；转染Tet-off基因表达调控系统的胃癌细胞SGC7901受强力霉素的诱导抑制；转染入胃癌细胞中的端粒片段可降低附近荧光素酶报道基因的表达水平。以上研究与结论进一步阐明染色体端粒结构和功能异常在胃癌发生发展中的作用，从全新的角度揭示了胃癌的发生机理。

目录

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英文缩写一览表

前 言

参考文献

第一部分胃癌7901细胞含有端粒片段质粒的植入和鉴定

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第二部分端粒植入细胞生长、端粒长度和端粒酶表达的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第三部分端粒植入对细胞生长相关基因和错配修复基因的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第四部分端粒位置效应研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文结论

致 谢

照 片1

照片2

照片3

照片4

文献综述一端粒位置效应与胃癌

文献综述二端粒、基因不稳定与胃癌

攻读博士期间发表的文章和参加会议及奖励