以APE1为靶点骨肉瘤基因放射治疗的实验研究

摘要

骨肉瘤是高度恶性的骨原发性肿瘤，由于辅助化疗和辅助放疗的应用，其5年生存率已由20年前的20％提高到50％～65％。放疗是临床治疗肿瘤最常用的方法之一，但有些肿瘤，如骨肉瘤对常规X射线、γ射线不敏感，在正常组织耐受限度内，巨型肿瘤及晚期肿瘤放疗效果较差，有必要寻找一种新的射线以有效地提高肿瘤局部控制率及患者生存率，目前最有希望的射线之一就是中子射线。并且，在放射线杀伤肿瘤细胞的同时，不可避免地会引起正常组织的损伤。因此，探寻增加肿瘤放射敏感性和放射效应的措施成为放射肿瘤学一个非常重要的课题。基因治疗能在增强放射治疗的效应的同时减少放疗的副作用，基因治疗与放疗相结合(基因放疗)是肿瘤治疗学领域一种非常重要的发展趋势。 DNA损伤修复基因，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/apyrimidinicendonuclease，APE1)，又称氧化还原因子(redoxfactor-1，ref-1)，具有抗细胞凋亡的功能，是低氧诱导细胞凋亡的重要保护因子，推测与肿瘤放射抗拒有关。RNA干扰(RNAi)技术阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点，完全有可能作为一种新的分子生物学工具成为肿瘤基因治疗的新手段。通过RNAi技术敲低(knockdown)肿瘤中APE1/ref-1的表达，以期提高放疗的敏感性。本项目应用MTT法、克隆形成分析和碱性彗星分析法检测骨肉瘤细胞受照射后的细胞存活率、形成克隆的能力以及DNA单链损伤情况，并用流式细胞仪检测细胞凋亡，分析放射线对骨肉瘤细胞的杀伤作用。应用RNAi技术，将pSilenceAPE1质粒转染入骨肉瘤细胞，敲低其APE1基因的表达，探讨APE1siRNA对锎-252中子射线的增敏作用。通过裸鼠荷瘤实验，荷瘤生长曲线观察和免疫组化等技术，探讨敲低APE1在骨肉瘤细胞的表达对增加放疗敏感性的作用。 研究目的 1.探讨锎-252中子射线和铱-192γ射线对HOS细胞的放射敏感性； 2.敲低DNA损伤修复基因APE1在HOS细胞中的表达，同时探讨其对锎-252中子射线的放射增敏作用； 3.通过肿瘤生长、病理组织学以及免疫组化等技术，观察pSilenceAPE1对放射治疗裸鼠骨肉瘤移植瘤的协同作用。 研究内容和方法 1.检测HOS细胞对γ射线及锎-252中子射线的敏感性。 通过MTT法、克隆形成分析和碱性彗星分析法检测HOS细胞受照射后的细胞存活率、形成克隆的能力以及DNA单链损伤情况。 2.APE1RNAi提高中子放疗敏感性的研究。 用脂质体将pSilenceAPE1质粒导入HOS细胞，通过RNAi技术，“敲低”HOS细胞中APE1的表达，同时给予锎-252中子射线照射，用MTT法、克隆形成分析和碱性彗星分析法检测放射效应，并用流式细胞仪检测细胞凋亡。 3.APE1RNAi提高骨肉瘤放疗敏感性动物实验研究 建立骨肉瘤裸鼠动物模型，观察pSilenceAPE1联合放疗对骨肉瘤生长抑制的协同作用，测量肿瘤的生长，绘制肿瘤生长曲线，HE染色，光镜观察肿瘤的组织学变化，免疫组化和TUNEL法检测肿瘤细胞APE1表达、微血管密度和细胞凋亡。 研究结果 1.检测HOS细胞对γ射线及锎-252中子射线的敏感性。 由克隆形成分析得到锎-252中子射线和铱-192射线照射人骨肉瘤细胞HOS的平均致死剂量(D0)值分别是2.80和3.34，准域剂量(Dq)值分别是2.66和3.07。锎-252中子射线和铱-192射线以200、500、1000cGy3个剂量照射HOS细胞后，碱性彗星尾力矩分别是6.664±0.648、20.322±1.433、33.909±1.245和4.760±0.528、15.203±1.272、27.375±1.315(P＜0.05)。 2.APE1siRNAi提高中子放疗敏感性的研究。 由克隆形成分析得到未转染APE1质粒与转染APE1质粒的HOS细胞经锎-252中子射线后的D0值分别是2.80和1.89，Dq值分别是2.66和2.00。以上HOS细胞以200、500、1000cGy3个剂量锎-252中子射线照射后，碱性彗星尾力矩分别是6.664±0.648、20.322±1.433、33.909±1.245和7.997±0.542、25.238±1.185、39.191+1.052(P＜0.05)；细胞凋亡率是4.00、5.91、9.63和5.68、7.55、13.51(P＜0.05)。 3.APE1RNAi提高骨肉瘤放疗敏感性动物实验研究 pSilenceAPE1+放疗联合治疗组的肿瘤生长延缓天数是对照组、pSilenceAPE1治疗组以及单独放射治疗组的2.30倍、1.74倍和1.51倍。APE1免疫组化染色显示pSilenceAPE1+放疗联合治疗组肿瘤细胞APE1表达显著降低。pSilenceAPE1+放疗联合治疗组微血管密度(MVD)为10.92±2.53，pSilenceAPE1治疗组MVD为19.38±2.62，单独放疗组MVD为23.36±2.71，对照组MVD为30.17±3.24，pSilenceAPE1+放疗联合治疗组MVD与对照组、pSilenceAPE1治疗组以及单独放疗组相比有显著性差异(p＜0.01)。原位末端标记技术检测肿瘤细胞凋亡情况，显示pSilenceAPE1+放疗联合治疗组肿瘤细胞凋亡率为(15.48±2.95)％，显著高于pSilenceAPE1治疗组(8.29±1.58)％、单独放疗组(9.12±1.74)％以及对照组(2.37±1.28)％(p＜0.01)。 结论 综上所述，锎-252中子对HOS细胞的杀伤效果优于铱-192γ射线，说明锎-252中子放射治疗骨肉瘤可能是一种具有发展潜力的放射治疗方法。pSilenceAPE1能显著敲低APE1在骨肉瘤细胞中的表达，显著诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖，降低微血管密度，提高骨肉瘤对放疗的敏感性，抑制骨肉瘤的生长，pSilenceAPE1基因联合放疗可能成为今后骨肉瘤治疗的新方法。

目录

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英文缩写索引

摘要

前言

第一部分检测人骨肉瘤细胞对γ射线及锎-252中子射线的敏感性

第二部分APE1 siRNA干扰提高中子放疗敏感性的研究

第三部分APE1 RNAi提高骨肉瘤放疗敏感性动物实验研究

全文总结

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一APE1/Ref-1与相关转录因子的研究进展

文献综述二肿瘤基因-放射治疗研究进展

研究生期间发表论文情况