靶向DC-SIGN的抗原特异性免疫应答研究

摘要

尽管疫苗的出现已经有效的改善了人类的健康进程，但对疫苗的设计仍有诸多改善的必要，尤其在各种新的感染性疾病层出不穷，癌症死亡率仍步步攀升的今天。因此，采取新的策略来改善疫苗的免疫原性，设计更为有效的治疗性疫苗是当前刻不容缓的问题。 树突状细胞(dendriticcells，DCs)是目前已知的功能最强大的职业抗原呈递细胞(profesionalantigenpresentingcells，pAPCs)，能以受体介导的内吞、巨吞饮和吞噬等方式高效的摄取外界抗原并以多种机制来呈递抗原；作为一个自然的免疫佐剂，在遭遇危险信号时能高表达CD80、CD83、CD86等共刺激分子，与MHC抗原肽复合物共同作用可有效的活化效应T细胞，并且是唯一能活化na(i)veT细胞的抗原呈递细胞；在静息状态(steadystate)的DCs细胞仍然可以有效的“抽样调查(sample)”外界抗原，并组成性的呈递(constitutivepresentation)这些无害的外来抗原和自身抗原(30-80％为自身合成缺陷的蛋白)，通过诱导调节性T细胞分化来诱导和维持外周耐受；DCs细胞兼具两种看似矛盾的功能，正是通过它对“自身”和“非自身”抗原的判断来决定免疫系统的不同反应，在适当的时候产生适当的应答或是耐受，从而维持机体免疫稳态；因此，利用DCs细胞来调控和改善治疗性疫苗的免疫效应，上调或是下调特定的免疫反应，一贯是治疗性疫苗设计的重要方向。 DCs细胞虽然具有强大的摄取抗原的功能，但它对抗原非特异的摄取和呈递的方式会造成疫苗不能被有效呈递，从而影响疫苗的后续效应。将抗原靶向DCs，利用DCs来改善疫苗的免疫原性是重要的疫苗设计策略。随着分子免疫学和DC细胞生物学的进展，许多在DC特异表达的分子被鉴定，寻找适当的靶向途径成为一个历久弥新的重要课题。 新近发现的一些DC限制性表达的凝集素受体成为目前关注的靶向新途径，例如DEC205和DC-SIGN。DC-SIGN(DC-specificintracellularadhesionmolecule-grabbingnonintegrin)受体是2002年发现的限制性表达于DC和某些组织巨噬细胞上的凝集素样受体，DC-SIGN已经被证实不仅是病原体受体，而且是重要的抗原受体，可有效的摄取处于粘膜组织的微量的HIV和CMV病毒颗粒，继之可以MHC-Ⅰ类分子和MHC-Ⅱ类分子限制性方式将抗原高效呈递出来，用人源化的鼠抗靶向DC-SIGN可以有效诱导na(i)veT细胞和记忆T细胞的免疫反应。综上，DC-SIGN的发现为靶向DC的疫苗设计提供了新的思路。 本研究采用DC-SIGN的高亲和力自然配体le(x)糖分子作为导向分子，利用生物素-链霉亲和素交联系统将糖分子与卵白抗原(ovalbumin,OVA)连接，由此制备了靶向DC-SIGN的抗原，然后观察了靶向抗原负载DC之后的对免疫应答能力的影响以及对DC本身功能状态的影响。 首先，利用Sulfo-SMCC异源双功能交联试剂交联链霉亲和素(streptavidin，SA)和模式抗原卵白蛋白，通过SDS-PAGE蛋白质电泳和Western免疫印迹方法证实SA与OVA蛋白成功交联，对电泳胶片的灰度扫描可估计，SA蛋白与OVA蛋白交联的分子摩尔比约为2/1；然后，ELISA方法证实SA-OVA复合物中的SA仍具有与生物素反应的功能，根据SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖饱和反应的比例(4.25μg：1μg)，获得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA复合物，1μgLe(x)糖分子饱和反应的SA-OVA复合物中含有约1.5μgOVA蛋白。由此获得由Le(x)寡糖介导的靶向抗原le(x)-OVA复合物。 其次，在得到靶向DC-SIGN的抗原之后，观察了靶向抗原是否能被DC-SIGN分子有效的摄取和内吞，通过荧光示踪的方法，le(x)-OVA靶向抗原在15分钟内被有效的摄取到表达DC-SIGN-EGFP绿色荧光融合蛋白的K562细胞中，染色OVA的红色荧光与绿色荧光有良好的共聚现象产生，抗DC-SIGN的mAb可以有效阻断K562-DC-SIGN-EGFP对le(x)-OVA的摄取，单核细胞来源的DCs也可在15分钟内高效内吞靶向抗原，但阻断mAb不能完全阻断原代DCs对le(x)-OVA的摄取，这可能与DCs对外界抗原强大的摄取能力有关，另外，用于检测DCs对le(x)-OVA摄取时抗原剂量不合适可能也是其中原因。 然后，通过ELIspot检测，胞内细胞因子染色和标准51Cr释放实验，进一步比较了靶向DC-SIGN的抗原和非靶向抗原在诱导抗原特异性免疫应答能力上的差异，研究发现，靶向DC-SIGN的抗原明显增强了包括CD8+T细胞的抗原特异性T细胞免疫应答，甚至在剂量低于非靶向抗原1000倍的情况下也能诱导相同水平的IFN-γ+细胞产生，CD40L能有效促进抗原特异性T细胞的活化。抗DC-SIGN的阻断mAb几乎完全抑制了靶向DC-SIGN的抗原对效应T细胞的活化，这说明DC-SIGN介导的抗原摄取途径对抗原的呈递以及继之的效应T细胞活化至关重要，DC-SIGN介导的摄取途径能促进外来抗原进入高效的抗原呈递通路，使微量的抗原也能有效呈递，从而促进抗原特异性T细胞包括CD8+T细胞的活化。 随着DC细胞生物学的发展和免疫调控机制研究的深入，DC细胞在调控免疫应答和维持免疫耐受方面的贡献进一步为人们所重视。有理论指出，如果将抗原靶向处于平稳状态的DC细胞抗原捕获受体，会导致抗原被组成性呈递，并诱导抗原特异反应T细胞的缺失和该抗原的重新刺激特异性的无反应性，即使在有强效佐剂的情况下。DC-SIGN受体不仅属于抗原捕获受体，更由于可与表达于静息T细胞上的ICAM-3发生粘附作用，因此被高度怀疑与免疫耐受有关。近来有文献报道DC-SIGN与某些自然配体相互作用可导致DC细胞成熟抑制，抑制性细胞因子IL-10分泌增加和Th1型极化抑制，例如来自于结核分支杆菌的ManLAM和幽门螺杆菌的含le(x)糖的脂多糖。 这些研究促使我们调查：在本研究中用于介导抗原靶向DC-SIGN的Le(x)寡糖是否也会在与DC-SIGN发生相互作用的同时介导某些免疫抑制信号的下传? 我们检测了不同组合刺激剂作用后的DC细胞上清，在靶向抗原le(x)-OVA单独作用和与CD40L协同作用的DC细胞上清中，没有观察到IL-10的分泌增加；但在le(x)-OVA与1-100ng/ml的LPS协同作用的DC细胞上清中，观察到有明显增强的IL-10的分泌，不含le(x)寡糖的OVA和SA-OVA没有观察到同样效应，这说明le(x)-OVA中的le(x)寡糖有促进LPS诱导IL-10分泌的作用；同样的体系中IL-6也呈现轻度的增加。IFN-γ的分泌没有明显变化。另外，作为DC细胞成熟标志之一的CD86分子，不仅在le(x)糖分子单独作用时没有明显的抑制表现，在与LPS同时作用的时候，仍然没有明显的表达抑制的现象；DC-SIGN的阻断抗体不能阻断le(x)寡糖分子聚合体与LPS协同作用下对IL-10分泌的促进作用，它事实上模拟了DC-SIGN配体与DC-SIGN的作用，促进了LPS对IL-10的诱导分泌作用。这说明，le(x)糖分子与DC-SIGN的相互作用并不类似于DC-SIGN与ManLAM之间的相互作用，不会介导DC细胞的成熟抑制和IL-10的分泌。但是，le(x)寡糖单体却并没有出现在le(x)-OVA中含有的le(x)寡糖聚合体类似的作用，在与LPS的协同刺激下，并没有表现出促进LPS诱导IL-10分泌的作用。DC-SIGN与同样寡糖分子不同组合形式的不同相互作用以及与不同佐剂之间的不同的协同作用暗示了一种免疫调控形式的存在，在适当的免疫佐剂作用下，例如CD40L，DC-SIGN受体与配体之间的作用能量也许是下游免疫应答发生与否至关重要的决定因素。 本研究结果表明：将抗原靶向DC-SIGN受体导致1，000倍更有效的抗原特异性T细胞的反应，尤其是CD8+T细胞的应答反应；在合适的免疫佐剂作用下，DC-SIGN与le(x)糖分子聚合体之间的相互作用不会导致DC细胞的成熟抑制及免疫抑制性细胞因子IL-10的分泌增加；利用le(x)糖分子聚合体来介导抗原靶向DC-SIGN受体是一个有效的促进抗原特异性T细胞免疫应答的方式，但未来的涉及靶向DC-SIGN的疫苗组分中必须包括适当的免疫佐剂。

目录

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摘要

前言

第一部分靶向DC-SIGN的le(x)-OVA抗原的制备

第二部分Le(x)-OVA的DC-SIGN靶向特异性研究

第三部分Le(x)-OVA靶向抗原的特异性免疫应答研究

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一模式识别受体在后天获得性免疫调控中的作用

文献综述二IL-10与免疫抑制

博士期间拟发表的文章