磷酸酶-张力蛋白同源物-PTEN与心肌细胞钙/心肌肥厚关系的研究

摘要

1.背景与目的： 研究证实，心肌肥厚是多种心血管病的共同病理结局，也是导致心力衰竭的重要结构基础，其主要特征是细胞体积增大、蛋白合成增加、胚胎型基因表达上调。早期的心肌肥厚可能是心肌细胞对内外界刺激的一种适应性改变，有一定的代偿意义，但持续的心肌肥厚最终会不可避免地导致心力衰竭，甚至猝死。由心肌肥大发展到心力衰竭，再由心力衰竭导致死亡，是临床心血管病人主要死亡的病理过程，临床研究表明逆转心肌肥厚能明显改善患者的预后。 心肌细胞内钙浓度([Ca2+]i)的变化在心肌肥厚中起了重要作用，是不同心肌肥厚信号通路的共同汇集点。研究表明，心肌细胞[Ca2+]i主要受心肌细胞外Ca2+和心肌细胞内Ca2+释放的两方面调节。心肌细胞膜外的Ca2+跨膜内流，如电压依赖性Ca2+通道和受体依赖性Ca2+通道；心肌细胞胞浆Ca2+贮存池释放，主要为分布在肌浆网(SR)的ryanodine敏感受体(RyR2)和IP3敏感受体(IP3R)，能分别被ryanodine和IP3激动，释放内贮Ca2+，释放内贮Ca2+进入胞浆。 既往关于心肌肥厚的研究主要集中在促心肌肥厚方面，即引起心肌肥厚的各种刺激是通过什么信号通路导致心肌肥厚，以及这些信号通路之间又是如何相互影响的。传统的药物，如ACEI、β-肾上腺素能阻滞剂等，虽能减轻心肌肥厚，但不能完全逆转。基于此种考虑，积极探索如何有效阻止心肌肥厚的机制就十分必要。我们提出一种假设，认为在心肌肥厚的过程中存在负性调控，即在促肥厚刺激的作用下，内源性抑制心肌肥厚因子被释放，以拮抗促肥厚刺激的促心肌肥厚作用，使得促肥厚/抗肥厚二者在一定阶段内维持平衡，阻止心肌肥厚的进一步加剧。促肥厚、抗肥厚二者之间是否平衡决定心肌肥厚的最终结局，当促肥厚占优势，心肌肥厚则进一步加剧，当抗肥厚占优势，则心肌肥厚被减轻或逆转。 磷酸酶-张力蛋白同源物—PTEN(PhosphataseandTensinHomologyDeletedonChromosomeTen)是1997年发现的一种抑癌基因，定位于人染色体10q23.3，全长200kb，有9个外显子和8个内含子。PTEN蛋白虽然没有SH2结构和跨膜信号，但其具有双特异性磷酸酶活性，即蛋白磷酸酶和脂性磷酸酶。PTEN的脂性磷酸酶通过PTEN/PI3K/PKB途径，使磷脂酰肌醇酯三磷酸(PIP3)去磷酸化，将PIP3转变为PIP2，逆转了PI3K对PKB磷酸化作用，从而抑制细胞生长、促进细胞凋亡。PTEN的蛋白磷酸酶活性能能使磷酸化的酪氨酸残基、丝氨酸/苏氨酸残基去磷酸化，对细胞周期、细胞黏附等起负性调控作用。Schwartzbauer等将野生型PTEN转染给原代新生小鼠的心肌细胞后，发现心肌细胞凋亡增加，caspase-3活性增强；而将突变型PTEN-H123Y转染心肌细胞后，却导致心肌肥厚(表现为心肌细胞蛋白质合成增加、细胞表面积增大、ANF表达上调)，caspase-3活性不受影响。Michael等敲除小鼠的PTEN基因，发现小鼠心脏外观明显增大，PTEN基因缺乏导致的心肌细胞肥厚有其独特的特点，表现为心肌细胞的长度、宽度均明显增加，但其长度、宽度之比却改变不明显；且其ANF、α-MHC、BNP等基因表达均无明显改变，仅有β-MHC表达增加，这和病理性心肌肥厚不同。说明PTEN基因缺乏导致的心肌肥厚类似与生理性心肌肥厚。 上述学者的研究均证明PTEN具有抑制心肌肥厚的作用。但是，目前还不明确心肌细胞内Ca2+如何影响PTEN；具有抑制心肌肥厚作用的PTEN在心肌肥厚中表达如何；ACEI类药物(如卡托普利)干预对其表达又有何影响。 本研究以培养的心肌细胞、心肌肥厚动物模型为研究平台，分别从细胞、组织水平去探讨上述问题：①以AngⅡ刺激心肌细胞外Ca2+内流，观察心肌细胞外钙内流对PTEN的影响；②以RY刺激心肌细胞内贮存的Ca2+释放，观察心肌细胞内钙释放对PTEN的影响；同时分别用硝苯地平阻断心肌细胞外Ca2+内流、钌红阻断心肌细胞内Ca2+释放、LY294002抑制PI3K酶活性，观察其对PTEN表达的影响；③建立心肌肥厚的动物模型，观察肥厚心肌组织的PTEN表达变化及卡托普利对其表达影响，初步阐明PTEN与心肌肥厚的关系。 2.方法 本研究分为3部分，第一部分用AngⅡ刺激心肌细胞，探讨心肌细胞外Ca2+内流对PTENmRNA和蛋白表达影响，同时测定心肌细胞3H-Leu掺入率以反映心肌细胞蛋白合成、心肌细胞外Ca2+内流与PTEN蛋白的亚细胞定位关系，同时还观察硝苯地平阻断AngⅡ介导心肌细胞外内流对PTEN表达影响、LY294002抑制PI3K酶活性后心肌细胞外内流对PTEN表达影响。第二部分用RY刺激心肌细胞，探讨心肌细胞内Ca2+释放对PTENmRNA和蛋白表达影响，同时测定心肌细胞3H-Leu掺入率，同时还观察钌红阻断RY介导心肌细胞内Ca2+释放对PTEN表达影响、LY294002抑制PI3K酶活性后心肌细胞内钙释放对PTEN表达影响。第三部分是建立心肌肥厚动物模型，测定血液动力学指标、心肌肥厚指标，电镜观察心肌组织超微结构，测定肥厚程度不同的心肌组织的PTENmRNA和蚩白表达及卡托普利干预对肥厚心肌PTEN表达影响。 3.结果 (1)AngⅡ能浓度依赖性(10-8mol/L～10-5mol/L)、时间依赖性增加心肌细胞内Ca2+浓度、心肌细胞3H-Leu掺入率。 (2)在10-8mol/L～10-5mol/L浓度范围内，随着AngⅡ介导心肌细胞外Ca2+内流的增加，心肌细胞PTENmRNA和蛋白表达均升高。 (3)用10-7mol/L的AngⅡ刺激心肌细胞，随着其刺激时间的延长，心肌细胞PTENmRNA和蛋白表达均升高。 (4)用10-7mol/L的AngⅡ刺激心肌细胞24h、48h，PTEN蛋白的亚细胞定位主要在心肌细胞胞浆，而胞核中没有PTEN蛋白表达。 (5)Nif在10-8mol/L～10-5mol/L浓度范围内，能浓度依赖性抑制AngⅡ介导胞外钙内流的促PTENmRNA、蚩白表达作用。 (6)不同浓度的LY294002(10-7mol/L～10-5mol/L)阻断PI3K酶活性后，心肌细胞外Ca2+内流的促PTEN表达作用明显减弱。 (7)RY能浓度依赖性(10-8mol/L～10-6mol/L)、时间依赖性增加心肌细胞[Ca2+]i、心肌细胞3H-Leu掺入率(RY在10-5mol/L时，心肌细胞[Ca2+]i和3H-Leu掺入率反而下降)。 (8)在10-8mol/L～10-6mol/L浓度范围内，随着RY介导心肌细胞内Ca2+释放的增加，心肌细胞PTENmRNA和蚩白表达均升高(RY在10-5mol/L时，心肌细胞PTENmRNA和蛋白却下降)。 (9)用10-7mol/L的RY刺激心肌细胞，随着其刺激时间的延长，心肌细胞PTENmRNA和蚩白表达均升高。 (10)用10-7mol/L的RY刺激心肌细胞24h、48h，PTEN蛋白的亚细胞定位主要在心肌细胞胞浆，而胞核中没有PTEN蛋白表达。 (11)钌红在10-8mol/L～10-5mol/L浓度范围内，能浓度依赖性地抑制RY介导胞内钙释放的促PTENmRNA、蛋白表达作用。 (12)不同浓度的LY294002(10-7mol/L～10-5mol/L)阻断PI3K酶活性后，心肌细胞内Ca2+释放的促PTEN表达作用明显减弱。 (13)持续皮下小剂量注射异丙肾上腺素能成功建立心肌肥厚动物模型，随着心肌肥厚程度的加重，PTENmRNA和蛋白表达均升高。 (14)卡托普利逆转心肌肥厚、改善血液动力学参数的同时，能上调心肌组织PTEN的表达。 4.结论 (1)心肌细胞外Ca2+内流能促进心肌细胞蛋白合成，增加PTENmRNA和蛋白表达。 (2)心肌细胞内Ca2+释放能促进心肌细胞蛋白合成，增加PTENmRNA和蛋白表达。 (3)PI3K酶活性与心肌细胞外Ca2+内流、心肌细胞内Ca2+释放对PTEN的促表达有关。 (4)小剂量持续给予ISO能建立心肌肥厚动物模型，随着心肌肥厚程度的加重，心肌组织PTENmRNA和蛋白表达均逐渐增加。 (5)卡托普利在改善血液动力学参数，抑制心肌肥厚的同时，还能上调肥厚心肌组织PTEN的表达，这可能是其抑制心肌肥厚的又一作用机制。 (6)外界促心肌肥厚因子在促进心肌细胞肥厚的同时，也激活了内源性心肌肥厚抑制因子-PTEN表达，提示心肌肥厚的过程存在负性调控，PTEN表达增加是负性调控的表现形式。

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摘要

前言

第一部分心肌细胞外钙内流对PTEN表达的影响

第二部分心肌细胞内钙释放对PTEN表达的影响

第三部分异丙肾上腺素介导心肌肥厚的PTEN表达与卡托普利干预对其影响

全文结论

致谢

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文献综述一PTEN与心肌肥厚

文献综述二心肌细胞钙信号系统

文献综述三心肌肥厚的分子机制及药物治疗研究进展

研究生期间发表的文章