幽门螺杆菌外膜蛋白双价亚单位融合疫苗的实验研究

摘要

目的： 幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是一种可定植于人胃粘膜表面的革兰氏阴性菌，现已证实Hp感染与慢性胃炎、消化性溃疡和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)发生密切相关。现行推荐的根除Hp感染的治疗方案(抗生素联合质子泵抑制剂或铋剂)虽然有效，但存在耐药菌株增加和药费昂贵等不可避免的问题。据文献报道，免疫接种对Hp感染同时具有预防和治疗的作用，因此，疫苗的研制已成为全球Hp研究的热点。 在疫苗研究中，筛选有效的免疫抗原是关键性的环节。目前大多数疫苗采用的是与Hp致病相关的毒力因子作为抗原成分，如尿素酶(urease)、热休克蛋白(heatshockprotein，Hsp)、空泡毒素(vacuolatingcytotoxin，VacA)、细胞毒素相关抗原(cytotoxinassociateantigen,CagA)、中性粒细胞激活蛋白(neutrophil-activatingprotein，NAP)等。革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。Lpp20、AhpC和UerB都是Hp的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，也是Hp疫苗重要的免疫抗原。但一直令学者们遗憾的是每种抗原单独免疫动物时，获得的保护率均不是很高，而多种抗原联合免疫才能达到较好的效果。 因此，本研究拟对Hp外膜蛋白Ahpc和Lpp20基因进行克隆表达，在此基础上，将这两个外膜基因分别与Hp保护性抗原成分尿素酶B亚单位的活性片段(UreB414)和粘膜佐剂-大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)构建融合基因。通过不同表达系统得到多亚单位的融合蛋白，分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用，为筛选有效的Hp疫苗抗原奠定基础。 方法： 1、采用PCR方法从HpCQ9803基因组中扩增lpp20、ahpC基因片段并构建在原核表达载体pET-22b(+)中，通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DnaStar和Genbank数据库分别对已公布的HpahpC和lpp20基因序列进行相似性分析。将含目的基因片段的重组载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，用AKTA-explore纯化仪纯化表达的重组蛋白rAhpC和rLpp20。应用SDS-PAGE方法对表达产物和纯化产物进行分析，用纯化的rAhpC和rLpp20免疫家兔，用兔抗Hp抗血清与重组蛋白、兔抗rAhpC和rLpp20抗血清与Hp分别进行Westernblot反应。 2、采用重叠延伸PCR的方法，以Lpp20或AhpC做为融合蛋白前端，与UreB414活性片段及粘膜佐剂LTB依次串联，在片段间引入5个氨基酸的柔性linkerGGGGS进行连接；将融合基因构建在原核表达载体pET-22b(+)中，经酶切及测序鉴定后，阳性重组子转化宿主菌E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导重组工程菌表达。SDS-PAGE电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白，DnaStar软件分析融合蛋白理化特性，通过包涵体洗涤，纯化条件摸索，AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白Lpp20+LTB-UreB(LUL)、AhpC+LTB-UreB(AUL)。纯化后的融合蛋白分别与GM1神经节苷脂进行结合试验。 3、将162只小鼠随机分为9组：PBS对照组、物理混合组(Lpp20+LTB、AhpC+LTB、Lpp20+LTB-UreB、AhpC+LTB-UreB、Lpp20+AhpC+LTB-UreB)、融合蛋白组(UreB414-LTB、Lpp20-UreB414-LTB、AhpC-UreB414-LTB)。分别于0、7、14、28天口服免疫，剂量为150μg/只/次。末次免疫后10天，每组取6只小鼠剖杀取样，ELISA检测口服免疫后血清特异性IgG、IgA、IgG1、IgG2a、粪便、肠道冲洗液slgA水平。每组余下12只口服108CFUHp动物适应株，30天后，取小鼠胃部标本通过Hp培养及特异性PCR检测，并计算口服免疫后各组攻毒保护率。 结果： 1、经酶切鉴定和基因测序结果显示，HpahpC和lpp20基因分别被正确克隆到pET22b(+)中，得到重组质粒分别命名为pET22b-Lpp20和pET22b-AhpC，ahpC基因的核苷酸序列长度为594bp，与Genbank中4个已知ahpC序列比较，同源性为96％-98％，氨基酸序列的同源性为98％-99％。lpp20基因的核苷酸序列长度为525bp，与Genbank中5个已知lpp20序列比较，同源性为96％-99％，氨基酸序列的同源性为98％-100％。重组工程菌IPTG诱导，经SDS-PAGE分析，重组质粒pET22b-Lpp20和pET22b-AhpC表达的目的蛋白分子量约为19KD和26KD，其表达产物分别占菌体蛋白的31.1％和37.6％。pET22b-Lpp20为可溶形式表达，pET22b-AhpC为包涵体表达，经AKTA-explore100蛋白纯化系统纯化，纯化后均得到纯度＞80％的目的蛋白。以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔，制备兔抗rHp-AhpC和rHp-Lpp20特异抗体，最后一次免疫后经免疫双扩散法检测，兔抗血清抗体效价均为1∶16，WesternBlot结果也显示重组蛋白能被兔抗Hp血清所识别，且兔抗rAhpC和rLpp20抗血清能与Hp天然外膜蛋白发生结合反应。 2、经酶切鉴定和基因测序结果显示，成功构建了包含Lpp20或AhpC、UreB414、LTB三个亚单位的融合基因，将融合基因LUL和AUL克隆到pET22b(+)载体上，得到融合蛋白表达载体pLUL和pAUL，DnaStra软件评价蛋白linker具有较好的柔韧性。将两个阳性重组子转化至E.coliBL21(DE3)后，37℃培养经IPTG诱导，表达的融合蛋白经SDS-PAGE和免疫印迹分析显示分子量约为45KD和50KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白的24.3％和32.7％。包涵体鉴定试验证实融合蛋白主要以包涵体形式表达，确定了采用亲和层析、离子交换层析相结合的纯化方法。纯化后得到纯度＞80％的融合蛋白。纯化后的两个融合蛋白分别能与GM1神经节苷脂发生结合反应，实验证实重组融合蛋白中LTB组分具有与GM1神经节苷脂结合的生物活性，说明融合蛋白保持了LTB的天然活性，具有粘膜佐剂活性。 3、ELISA检测融合蛋白rAUL和rLUL免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA，粪便，肠道冲洗液sIgA水平与PBS组相比，升高明显，差异极显著(p＜0.001)，与亚单位免疫组相比，差异显著(p＜0.05)，与多亚单位蛋白物理混合组相比，差异不显著(p＞0.05)。免疫攻毒后，融合蛋白组小鼠的免疫保护率为：rAUL组70％(7/10)，rLUL组75％(9/12)，统计分析显示，融合蛋白组免疫保护率与PBS组相比，差异极显著(p＜0.001)，与rAhpC和rLpp20组相比，差异显著(p＜0.05)，与rAhpC+rLU和rLpp20+rLU组相比，差异不显差(p＞0.05)。 结论： 1、成功克隆到Hplpp20和ahpC基因，与Genbank已公布的Hp菌株基因序列具有高度同源性。纯化的基因重组蛋白rLpp20和rAhpC，具有良好的免疫原性和免疫反应性，可以做为Hp基因工程疫苗候选组分的抗原。 2、成功构建、表达融合蛋白rAUL和rLUL，纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性，融合基因间的Linker对融合蛋白的立体构象影响较小。 3、小鼠体内特异性抗体水平及免疫保护效果都证明融合蛋白rAUL和rLUL具有良好的安全性和免疫保护效果。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书

英文缩略表

摘要

前言

第一部分幽门螺杆菌外膜蛋白AhpC和Lpp20亚单位克隆表达及纯化

第二部分幽门螺杆菌外膜蛋白双价亚单位蛋白疫苗的构建、表达和纯化

第三部分BALB/c小鼠口服幽门螺杆菌外膜蛋白多亚单位蛋白疫苗的免疫保护试验研究

全文总结

致谢

参考文献

文献综述　幽门螺杆菌基因工程疫苗研究进展