钙调神经磷酸酶在创伤性轴突损伤中的作用及机理

摘要

弥漫性脑轴突损伤(Diffuseaxonalinjury，DAI)是创伤导致的广泛性脑实质轴突损伤，是非火器颅脑损伤中最严重的颅脑损伤之一。虽然随着影像学的发展，DAI的临床诊断有了一些进步，但在治疗方面尚无有效手段。 DAI的发生是由于外力直接或间接作用，神经组织损伤后的继发改变和损伤后修复反应等诸多因素共同介入的结果。但究其发生的生物力学机理而言，它应该是所有的创伤性颅脑损伤的共同特征，因此也被称为创伤性轴突损伤(TraumaticAxonalIniury，TAI)。它一般表现为两种情况：当外力引起的原发性损伤过于强烈时，轴突会直接离断，即离断型轴突损伤；同时，当原发性损伤不足以引起轴突离断时，即存在非离断型轴突损伤。但是，随着继发性损伤的参与，部分非离断型轴突损伤在4～24h后也会转变为离断型轴突损伤。因此，保护非离断型轴突损伤的轴突，促进其自我修复，促进轴突再生无疑是治疗TAI的重要策略。 钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)是一种活性受Ca2+/钙调素调控的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在细胞信号传递中直接受Ca2+的调节，起脱磷酸化作用。它是脑内含量最高的蛋白酶之一，主要分布在神经元胞体和轴突、树突中。作为一种胞内信号蛋白，目前研究发现CaN在中枢神经系统参与了许多神经细胞功能的调节：如免疫炎症反应、突触可塑性、神经元凋亡等。而CaN在创伤性轴突损伤中的作用也日益引起人们的关注。一些动物实验表明，轴突损伤后给以CaN的抑制剂环孢霉素A(cyclosporineA，CsA)或FK-506，反映前向转运障碍的TAI指标--APP(amyloidprecursorprotein，APP)的阳性染色轴突会减少，动物的运动功能有所改善，间接证明CaN参与了TAI的发生、发展。但目前有研究还发现FK-506还存在其它方式干预TAI。因此，CaN在TAI中确切的作用和机理有待于更深入的研究。 本研究于是从三个方面入手探讨了CaN在TAI中的作用和机理： 1)通过比较研究不同年龄段大鼠皮层神经元CaN的活性变化，探讨CaN与轴突再生能力的相关性； 2)培养大鼠大脑皮层神经元，在3、7、10d分别给予10nMCsA、10nMBDNF、10nMTTM(PP-1的抑制剂)后，检测神经元的神经突起的长度、CaN的活性、βⅢ-tubulin、P-CREB、P-GAP-43蛋白表达，探讨CaN在正常轴突生长中的作用及机理。 3)离体牵张损伤大脑皮层神经元构建轴突损伤模型，在损伤后分别给予10nMCsA、10nMTTM后，1h、6h、24h、3d观察神经元形态改变，检测CaN的活性、APP、βⅢ-tubulin、P-GAP-43蛋白表达，进一步探讨CaN在轴突牵张损伤后对轴突的作用以及机理。 本课题的主要结果和结论 1.酶底物显色法检测发现：随着大鼠年龄的增加，其大脑皮层的CaN活性呈逐步增加的趋势。这可能是成熟神经元与未成熟神经元自我修复能力差异存在的线索。 2.培养的新生大鼠皮层神经元在加入CsA后，其CaN的活性遭到显著抑制；而BDNF刺激后，CaN活性没有发生明显改变。这说明CsA能够通过抑制CaN的活性而影响其后续效应。 3.相差显微镜下数码采集细胞生长照片，SPOT软件分析：神经元突起的长度在3-10d随着培养时间是逐渐增长，有显著的差异。CsA、BDNF和TTM分别刺激后，神经突起的增长更加明显，而三种刺激的组间差别不明显。这提示CsA与TTM可能具有BDNF那样促进神经突起生长的效果。因PP-1是CaN已知的一个作用底物，所以CsA的上述作用可能是通过PP-1进行的。 4.Westernblot检测发现：βⅢ-tubulin、P-GAP-43、P-CREB的蛋白表达在3-10d有增加的趋势，但统计学无显著差异。CsA刺激后这些蛋白表达均显著增加，但TTM的刺激却只使βⅢ-tubulin、P-CREB的增加明显。这提示CaN既可能直接影响GAP-43的磷酸化而影响轴突生长，还能通过PP-1、CREB发挥间接影响。 5.TAI损伤模型的建立：通过牵张损伤培养7d的大脑皮层神经元模拟在体损伤过程，是目前体外研究TAI较理想的模型。它具有操作简便、损伤条件控制精确、重复性好等优点。 6.SPOT分析、Westernblot、酶底物显色法检测发现：牵张损伤后CsA处理能显著减少伤后3d内APP的蛋白表达，而TTM处理，上述结果未发生显著改变。这提示CsA对TAI具有一定治疗作用。鉴于CsA还能抑制伤后CaN活性的显著增加，说明CsA的确通过了CaN在发挥作用，而PP-1通路对轴突损伤急性期的治疗作用不明显。 7.Westernblot检测还发现：βⅢ-tubulin、P-GAP-43的蛋白表达在损伤后3d内未发生明显改变。伤后CsA的干预未能改变24h内两种蛋白表达的结果，但在伤后3d却比对照明显增加。这提示CsA能在伤后3d开始通过促进βⅢ-tubulin、P-GAP-43的表达而影响轴突的自我修复或再生。伤后TTM的干预只在伤后3d增加了βⅢ-tubulin的蛋白表达。这提示CsA能通过了PP-1通路在伤后影响了βⅢ-tubulin的蛋白表达。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写表

声明

前言

第一部分 CaN与大脑皮层神经元轴突自我修复能力的相关性研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 CaN在大脑皮层神经元轴突生长中的作用及机理研究

实验一 CaN在大脑皮层神经元轴突生长中的作用

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

附图

实验二 CaN在大脑皮层神经元轴突生长中的作用机理

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分 CaN在轴突损伤中的作用及机理研究

实验一 轴突损伤模型的建立

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

附图

实验二 CaN在轴突损伤中的作用及机理

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

全文结论

致 谢

文献综述一 弥漫性轴突损伤的临床与研究

文献综述二 中枢神经系统轴突生长或再生的影响因素

攻读期间发表论文情况