ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞株增殖、凋亡及VEGF表达的影响及其机理研究

摘要

全反式维甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)已被证实具有有效诱导分化及抑制肿瘤细胞生长的作用，其对肺癌的防治作用正日益受到广大学者的重视。但国外最近应用ATRA前体—β-胡萝卜素保护肺癌高风险人群的两个大样本实验研究却发现：高剂量的β-胡萝卜素摄入，非但不能保护吸烟及接触石棉的人群，反而增加其发生肺癌的风险；有证据表明ATRA具有刺激血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)基因转录及蛋白表达的作用；另外尚存在ATRA有效作用剂量大、有较大的毒副反应以及某些肿瘤对其具有抗药性等问题，这些缺点制约了ATRA的实际应用价值。5，7，4'-三羟异黄酮(Genistein)是一种天然的酪氨酸蛋白激酶抑制剂，其抗癌作用近年来倍受关注。一定剂量的Genistein既能诱导肿瘤细胞分化又具有促其凋亡的作用，但单独使用Genistein对肿瘤细胞的诱导分化和促凋亡作用均较弱。因此，研究如何既能减低抗瘤药物剂量、以减轻其毒副作用，又能增强或不减弱药物的抗肿瘤效果就显得十分重要；有学者就认为探索低剂量多药联合应用，是肿瘤药物治疗研究的一个十分重要的方向。本课题拟通过比较ATRA或Genistein单药与两者联合使用对A549人肺腺癌细胞株增殖、凋亡及VEGF表达的影响，验证联合用药较之单独用药是否在增强药物抗肿瘤效果的同时，降低促进VEGF基因转录、蛋白表达以及可能的促肿瘤血管生成的潜在风险；在此基础上，进一步研究联合使用ATRA和Genistein对凋亡相关基因Bcl-2、Bax以及细胞周期相关分子pRb、CDK4、CyclinD1等表达的调节作用，探讨ATRA联合Genistein增强抗肿瘤效应的分子机制。 研究目的 1.通过研究ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，验证联合用药在抑制A549细胞增殖及促其凋亡方面的协同作用； 2.通过研究ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞凋亡相关基因及细胞周期相关分子表达的影响，探讨联合用药对A549细胞凋亡及细胞周期影响的分子机制； 3.通过研究ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞ICAM-1、MUC1及VEGF表达的影响，探讨联合用药对A549细胞侵袭、转移潜能的影响，为ATRA联合Genistein防治肺癌提供实验依据。 研究内容和方法 1.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞增殖及细胞周期的影响 通过单独使用不同剂量ATRA或Genistein及两者联合处理A549人肺腺癌细胞株，动态观察A549细胞生长情况，采用MTT法检测其增殖抑制情况，流式细胞仪进行细胞周期分析及凋亡率检测；分析ATRA联合Genistein能否增强抗肿瘤效应。 2.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞凋亡相关基因及细胞周期相关分子的影响 单独使用50μMATRA或40μMGenistein及两者联合处理A549人肺腺癌细胞株，运用TUNEL法检测细胞凋亡情况，Westernblotting法检测凋亡相关基因蛋白和细胞周期相关分子的表达情况，荧光定量PCR法检测凋亡相关基因及细胞周期相关mRNA的表达情况；探讨ATRA联合Genistein对A549细胞增殖及凋亡影响的分子机制。 3.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞ICAM-1、MUC1及VEGF表达的影响 单独使用50μMATRA或40μMGenistein及两者联合处理A549人肺腺癌细胞株，流式细胞仪检测细胞表面ICAM-1的表达；免疫细胞化学法或Westernblotting法检测MUC1及VEGF蛋白的表达情况；荧光定量PCR法检测MUC1及VEGFmRNA水平的表达情况，分析ATRA联合Genistein对A549细胞侵袭、转移相关分子的表达影响。 研究结果 1.人肺癌细胞A549经单独使用ATRA或Genistein及两者联合处理后，细胞增殖能力明显下降，且各处理组随药物剂量增加和作用时间延长，抑制效应逐渐增强，其中联合用药组抑制效应最为明显。单用50μMATRA可使A549细胞的G2/M期减少(2.27±1.34％vs5.50±3.62％,vs对照组，P＜0.05)，S期无明显变化，细胞阻滞于G0/G1期(68.62±4.10％vs62.75±5.05％，vs对照组，P＜0.01)；单用40μMGenistein可使A549细胞的S期比例明显减少(22.55±1.77％vs31.76±9.60％，vs对照组，P＜0.01)，G0/G1期无明显变化，细胞阻滞于G2/M期(15.20±4.23％vs5.50±3.62％，vs对照组，P＜0.01)；而经两者联合处理的A549细胞主要表现在S期比例明显减少(22.84±4.36％vs31.76±9.60％，vs对照组，P＜0.01)，停滞于G2/M期的比例显著增高(11.20±2.62％vs5.50±3.62，vs对照组，P＜0.01)。 2.Genistein可以从蛋白水平抑制CDK4的表达(vs对照组，P＜0.05)，当ATRA联合Genistein处理A549细胞后，CDK4蛋白水平较对照组与ATRA单药组明显下降(vs对照组，P＜0.01；vsATRA组，P＜0.01)；Genistein单药及联合用药组均可上调A549细胞Rb蛋白表达，而ATRA单药处理后，Rb蛋白表达无明显变化(vs对照组，P＞0.05)；经Genistein处理后p-ERK1/2无明显变化(vs对照组，P＞0.05)，而经ATRA处理后，p-ERK1/2水平明显下降(vs对照组，P＜0.01)，当ATRA联合Genistein处理A549细胞后，p-ERK1/2水平较对照组明显下降(vs对照组，P＜0.01)，但下降程度比ATRA单药组稍弱(P＞0.05)。在A549细胞中CyclinD1mRNA水平较高，经Genistein处理后CyclinD1mRNA无明显变化(vs对照组，P＞0.05)，而经ATRA处理后，CyelinD1mRNA水平明显下降(vs对照组，P＜0.05)；当ATRA联合Genistein处理A549细胞后，CyclinD1mRNA水平较对照组明显下降(P＜0.05)，但下降程度比ATRA单药组稍弱(vsATRA组，P＞0.05)。 3.单独使用50μMATRA或40μMGenistein处理A549细胞24h、48h，均可促其凋亡，而联合用药组的作用更为明显。但联合处理48h之后A549细胞凋亡指数较24h处理组减低(23.02±7.34％vs28.33±6.49％,P＜0.05)，镜下观察细胞数明显较前减少，细胞碎片多，提示联合处理组可能早期以细胞凋亡为主，而后期则可能以细胞坏死为主。 4.A549细胞经单独使用50μMATRA或40μMGenistein或联合用药处理后，Bcl-2蛋白表达均明显下调(P＜0.01)；而Bax蛋白表达水平在经单独使用ATRA或联合用药处理后明显上调(分别与对照组比，P＜0.01)，而经Genistein处理后虽有上调趋势，但相差不显著(vs对照组；P＞0.05)；各处理组Bax/Bcl-2的比值明显增高，尤其以联合用药组更为明显(vsATRA组,P＜0.01；vsGenistein组,P＜0.05)。 5.当ATRA处理A549细胞后，细胞表面的ICAM-1表达阳性率(10.13±1.68％)较对照组(14.12±4.87％)下调(P＜0.05)，经Genistein处理后，ICAM-1表达阳性率(16.62±7.37％)无明显变化(P＞0.05)，而当两者联合应用时ICAM-1表达阳性率(8.36±1.31％)明显低于对照组(P＜0.01)。 6.ATRA与Genistein单药，均可使MUC1mRNA表达有下调趋势，但无统计学差异；而联合用药组抑制效果非常明显，与对照组及各单药组相比，均有显性差异(vs对照组，P＜0.01；vsATRA组，P＜0.05；vsGenistein组，P＜0.01)。 7.ATRA处理组VEGFmRNA较对照组有增高趋势，在联合用药后，VEGFmRNA的表达有下降趋势，但均无统计学差异。 结论 1.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞的增殖具有协同抑制作用，对肿瘤细胞有丝分裂的抑制是其重要的环节，可能通过上调抑癌基因Rb的表达，并抑制CDK4、CyelinD1、p-ERK1/2基因或/和蛋白的表达及活性实现。 2.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞凋亡具有协同促进作用，可能与两者协同调节Bax/Bcl-2的比值增高有关。 3.ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞ICAM-1、MUC1表达具有明显的协同抑制作用，因而可能对肺癌细胞的侵袭、转移潜能有抑制作用。 4.ATRA在抑制肺癌细胞增殖的同时可能促使肿瘤血管的生成，而Genistein具有较强的抑制酪氨酸蛋白激酶的作用，可以明显抑制VEGF的表达。ATRA和Genistein联合使用明显增强药物抗瘤效应，又有效避免ATRA促进VEGF表达的潜在风险，因而可能成为肺癌化疗的新的策略之一。

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摘要

前言

第一部分ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞株增殖及细胞周期的影响

第二部分ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞株凋亡相关基因及周期相关分子表达的影响

第三部分ATRA联合Genistein对A549人肺腺癌细胞株ICAM-1、MUC1及VEGF表达的影响

全文结论

致谢

附图

参考文献

文献综述一大豆异黄酮抗瘤效应及其机制的研究进展

文献综述二MUC1与NSCLC的研究进展

研究生期间发表论文情况