约氏疟原虫子孢子侵入相关基因分析及235kDa棒状体蛋白研究

摘要

蚊媒传播的疟疾是一种严重危害人类健康的热带传染病，在全世界人群中具有很高的发病率和致死率。近年来疟原虫多药抗性株的出现与迅速扩散，以及蚊媒对杀虫剂耐受性的增加，目前又无有效的抗疟疫苗，给疟疾防治工作带来很大的困难。传统方法已难于控制该病的流行，迫切需要为疟疾的防治工作提供新的方法和手段。疟疾是由蚊虫叮咬而传播，疟原虫子孢子一旦进入血循环，数分钟后便随血流跨过肝血窦枯否氏细胞(Kuppfercell，KC)后主动粘附、迅速侵入肝细胞，并进行红外期增殖，然后进入红细胞，导致疟疾的发作。子孢子侵入肝细胞是疟疾感染的关键，而阻断虫体的侵入，即可防止疟疾感染，红外期阻断疫苗旨在阻断子孢子侵入宿主肝细胞，防止疟原虫红内期的发育，是疟疾疫苗的重要组成部分。 唾液腺子孢子感染性受发育调节。正常情况下，中肠内卵囊成熟后破裂，子孢子逸出，经血淋巴移行到唾液腺后2d，发育成为具有感染性的子孢子。因此研究疟原虫具有侵入肝细胞能力的唾液腺子孢子与不具侵入肝细胞能力的卵囊子孢子之间的差异分子具有重要意义。通过对疟原虫子孢子不同时相点侵入相关基因和蛋白的研究与鉴定，将有助于认识疟原虫生长发育的分子机制，可为疟疾的防治提供分子理论依据，提供药物和疫苗新的靶目标，为采取防治策略战胜疟疾打下了坚实的基础。 在后基因组时代，对基因功能的分析已成为当前的主要任务。而功能基因组学最大的技术挑战是关于蛋白表达的分析(蛋白质组学)。在本实验室前期的研究中，应用蛋白质组学的二维凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/inoizationtimeofflyingmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)分析技术和蛋白质信息学等方法对约氏疟原虫卵囊子孢子和唾液腺子孢子这两个不同发育时期虫体的可溶性蛋白进行了分析研究。结果显示相对于卵囊子孢子，在唾液腺子孢子中确定比较明显的差异蛋白点有六个，分别为PyDp1～6(Plasmodiumyoeliidifferentialprotein1～6)。这些差异蛋白点主要为一些膜蛋白、表面蛋白和运动相关的蛋白。推测这些蛋白可能与疟原虫子孢子黏附、侵入肝细胞相关，可能为新的阻断策略和疟疾多价亚单位疫苗的靶目标。因此，加强这些差异表达蛋白的研究可为分子水平上筛选和发展抗疟药物和促进疫苗研制奠定理论基础。 对约氏疟原虫子孢子差异表达蛋白的结果进行研究分析发现，差异蛋白点PyDp1(pI：pH4，MW：24×103)与疟原虫顶端复合体棒状蛋白Py235(Plasmodiumyoelii235kDarhoptryproteins，Py235)相匹配。Py235是一组能够协助疟原虫侵入宿主细胞，与疟原虫的侵袭力密切相关的高分子量蛋白(235kDa)。在红内期，Py235蛋白参与对红细胞进行选择性侵入，并在多个不同侵入阶段均有表达。Py235存在于唾液腺子孢子中，推测其可能与子孢子侵入肝细胞相关。 因此本实验以斯氏按蚊-约氏疟原虫为模型，在本实验室的饲养条件下，对目前较明确的疟原虫子孢子侵入相关基因进行定性及半定量分析，以确定采集子孢子样本的最佳时相点。再从唾液腺子孢子期表达的差异蛋白中选择差异蛋白点PyDp1为研究基础，结合生物信息学技术对实验获得的肽质量指纹图谱(peptidemassfingerprint，PMF)进行分析鉴定。参考约氏疟原虫235kDa棒状体蛋白的氨基酸序列及其相对应的核酸序列，利用primer5.0软件设计Py235引物，经RT-PCR方法与T-A克隆技术及核酸测序从约氏疟原虫子孢子中克隆到Py235基因部分序列，并在此基础上对Py235基因进行原核表达研究，同时在基因水平利用DNA斑点杂交对Py235基因在唾液腺子孢子的表达进行定性分析，从而为进一步研究提供理论依据。 其实验内容和结果主要包括以下三个方面： 1、在约氏疟原虫-斯氏按蚊模型的基础上，通过建立RT-PCR方法并结合Qantity-One凝胶分析软件，对蚊体内约氏疟原虫卵囊子孢子发育为唾液腺子孢子不同时相点的环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein，CSP)与红细胞结合蛋白(apicalmembraneantigen-erythrocyte-binding-likeprotein，MAEBL)基因表达进行检测。结果提示，按蚊体内子孢子发育过程中CSP和MAEBL表达量的持续增加，并在唾液腺子孢子中达到峰值。随着子孢子发育的越成熟，基因表达量越高。这为研究其它侵入相关基因的表达奠定了理论基础。 2、本研究以唾液腺子孢子差异蛋白点PyDp1为研究基础，结合生物信息学技术对实验获得的肽质量指纹图谱进行分析鉴定，获得Py235棒状体蛋白氨基酸序列及对应的核酸序列，参考这些序列结果，利用primer5.0软件设计Py235引物。应用RT-PCR方法及定向克隆技术和pET表达系统，构建了原核表达载体pET28a(+)-Py235以及工程菌株XL1-Blue-pET28a(+)-Py235。经IPTG诱导，工程菌株XL1-Blue-pET28a(+)-Py235成功表达了以包涵体形式存在的Py235融合蛋白。为进一步深入的分析该蛋白的二级结构、空间构象及功能结构域等研究提供了基础。 3、以获得的Py235基因测序结果设计特异的寡核苷酸探针并在5'端标记地高辛，通过地高辛标记的Py235基因探针与唾液腺子孢子DNA进行斑点杂交反应。结果显示Py235基因探针可以和相应的唾液腺子孢子基因组反应，并且有比较好的特异性和敏感性，进一步证实了目的基因的存在。 通过对蚊期约氏疟原虫子孢子侵入相关基因的分析及Py235蛋白的研究，为研制新的、高效的抗疟原虫的疫苗及新药的开发提供了理论基础。

目录

第三军医大学研究生学位论文独创性声明及第三军医大学研究生军医大学研究生学位论文版权使用授权书

英文缩写一览表

摘要

前言

第一部分约氏疟原虫子孢子侵入相关基因分析

第二部分 约氏疟原虫子孢子235kDa棒状体蛋白研究前言

第二部分 约氏疟原虫子孢子235kDa棒状体蛋白研究实验一 py235基因的原核表达

第二部分 约氏疟原虫子孢子235kDa棒状体蛋白研究实验二 DNA斑点杂交

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 疟原虫蚊期发育、侵入相关基因的研究进展

攻读硕士学位期间撰写的论文