抑制性寡核苷酸（CpG-N ODN）拮抗刺激性寡核苷酸（CpG-S ODN）的作用及其机制研究

摘要

目的:脓毒症(Sepsis)是由感染因素引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，病死率高。细菌基因组DNA(细菌DNA)是SIRS的主要启动因子之一。研究发现只有含有未甲基化CpG为核心的特定六核苷酸序列的CpG ODN才具有刺激性，它的特征结构通常是5'-嘌呤-嘌呤-CG-嘧啶-嘧啶-3'。这些特定的六核苷酸既是脊椎动物免疫细胞特异性识别细菌DNA(CpG DNA)的结构基础，也是细菌DNA具有广泛免疫刺激效应的结构基础，因此被称为刺激性CpG基序(stimulatory CpG motif；CpG-S ODN)。此外，研究尚发现部分CpG ODN对细胞的刺激活性较弱，并能对CpG-S ODN活化细胞有抑制作用，因此推断这些序列可能是中和性CpG基序(neutralizing CpG motif；CpG-N ODN)。本研究旨在进一步寻找有效的CpG-N ODN，并对其可能的机制进行探讨，为CpG-N ODN的可能临床应用提供实验依据。 方法:①hPBMC分别用生理盐水(NS)、CpG-S ODN 和CpG-S ODN+CpG ODN(101-211)刺激后，观察CpG ODN(101-211)对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的作用，寻找有效的CpG-N ODN。②hPBMC分别用生理盐水(NS)、CpG-S ODN和CpG-S ODN+CpG-N ODN刺激后，观察CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的抑制作用，并明确其量效、时效关系；ELISA法检测培养上清TNF-α的含量；③采用流式细胞术观察CpG-N ODN对hPBMC细胞表面结合和内化CpG-SODN的影响；④采用生物传感技术观察CpG-S ODN与CpG-N ODN是否具有直接结合作用；⑤采用RT-PCR技术观察CpG-N ODN预处理对hPBMC中TLR9 mRNA表达的影响；⑥采用电泳迁移率改变分析(EMSA)方法观察CpG-N ODN预处理对hPBMC中NF-kB活化的影响；⑦采用MTT法检测CpG-N ODN对细胞活性的影响。 结果:①从CpG ODN(101-211)找出对CpG-S ODN诱导hPBMC释放细胞因子具有抑制作用的CpG-N ODN；②当CpG-N ODN与CpG-S ODN浓度比为1：1时，hPBMC释放细胞因子的作用受到抑制，提前和与CpG-S ODN同时给CpG-N ODN均可抑制hPBMC分泌细胞因子，且抑制效果相当，约为25％；延后给予则未见抑制效应；③10 μg/ml CpG-N ODN预处理可明显抑制10 μg/ml CpG-S ODN的hPBMC表面结合和内化；④CpG-S ODN与CpG-N ODN没有直接结合作用；⑤CpG-N ODN预处理能显著抑制hPBMC中TLR9 mRNA的表达；⑥CpG-N ODN预处理能显著抑制hPBMC中核转录因子NF-kB的活化。⑦CpG-N ODN对细胞活性没有影响。 结论：从前期合成的CpG ODN中筛选出了有效的CpG-N ODN，CpG-N ODN处理可明显抑制CpG-S ODN诱导的hPBMC分泌TNF-α，其作用机制可能与其抑制CpG-S ODN在细胞表面的结合以及内化、抑制TLR9 mRNA的表达、进而抑制NF-kB的活化、导致细胞释放TNF-α等细胞因子减少有关。

目录

论文说明：英文缩写一览表

声明

摘要

前言

第一部分CpG-N ODN的筛选

材料与方法

结果

讨论

第二部分CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分CpG-N ODN抑制CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的作用机制研究

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述一CpG DNA的免疫刺激作用及其应用

文献综述二胸腺素α1的免疫调节活性及临床应用

研究生期间发表的文章