改性胶原支架组织工程化脊髓修复成年鼠脊髓损伤的实验研究

摘要

背景：脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)后的神经再生一直是生物医学界研究的一个重要课题。近年来的基础研究表明脊髓损伤后仍存在一定再生能力，一些实验结果令人鼓舞，然而成年哺乳动物脊髓损伤后的修复仍十分困难。组织工程为脊髓损伤的研究提供了一条新的修复途径，其三大支柱是“理想的种子细胞+合适的支架材料+细胞因子”，其中支架材料必须具有以下性能：(1)良好的细胞和组织生物相容性；(2)细胞能在材料表面良好粘附和增殖；(3)材料能够诱导细胞按预制形态生长；(4)可控的生物降解吸收性，在新组织长成后，材料能够在体内降解成对人体无毒的小分子，并通过代谢排出体外；(5)具有高孔隙度的三维立体结构；(6)具有可塑性和适宜的力学性能。 目前构建脊髓组织工程的支架材料按来源可分为两大类，即天然生物材料和人工合成材料。天然生物材料最大优点是可降解、生物相容性好，降解产物易于被吸收而不产生炎症反应，但是存在力学性能差，降解性能不易调控。人工合成材料中可降解性高分子材料降解速度和强度易调节，容易塑型和构建高孔隙度三维支架，但该类生物材料的缺点在于降解产物会对细胞的产生不利影响。 天然生物材料中胶原来源广泛，具有良好生物相容性和特殊的生物可降解性，降解产物氨基酸可以被机体完全吸收，是最早被应用的天然生物材料。已经有研究表明胶原具有特异性的分子识别信号，可促进细胞的粘附和增殖，诱导细胞的分化，可为细胞生长提供支架。然而，由于胶原力学强度和降解速率的限制，使其难以单独作为组织工程中的支架材料来进行组织器官的体外构建。因此对胶原材料进行改性，在保持其良好的生物相容性基础上有效提高其力学性能并降低其降解速度，是胶原材料在组织工程中得以广泛应用的前提。 本实验拟体外构建天然支架材料胶原并对其进行交联改性，并通过支架材料的性能测试和生物相容性研究与人工合成材料PGA，PLGA进行比较。然后选择脊髓源性神经干细胞作为种子细胞接种在筛选出来的支架材料上，再以胚胎脊髓悬浮液(Fetalspinal cord extracts，FSCE)提供NSC生长分化所需的细胞因子和细胞外基质，以期构建组织工程化脊髓用于移植修复成年大鼠脊髓损伤。 目的：选择合适的支架材料，利用组织工程技术构建组织工程化脊髓，研究其在修复成年大鼠脊髓损伤中的作用。 方法：1.神经干细胞的培养和诱导分化。分离和克隆扩增孕14天SD大鼠胚胎脊髓神经干细胞，行Nestin免疫荧光染色鉴定；制备FSCE并将其加入到在体外培养的NSC中，并在第3、7天进行免疫荧光细胞化学鉴定，以观察其对NSC的诱导分化作用。对照组以10％的胎牛血清进行诱导分化。2．组织工程支架材料的选择。制备鼠尾源性胶原海绵支架，并分别通过化学交联(EDC交联)和物理交联(DHT交联)对支架进行交联改性；构建PGA和PLGA支架；通过力学性能测试，孔隙率测定，降解率测定及生物相容性实验和电镜扫描来比较上述5种支架材料，并选择出最为合适的支架材料。3．组织工程化脊髓的体外构建。将神经干细胞种植在筛选出来的支架中，以胚胎脊髓提取液对其进行诱导分化72小时，通过HE染色、免疫荧光组织化学检测和扫描电镜观察，了解其组织结构。4．组织工程化脊髓移植修复成年鼠急性脊髓损伤。制作脊髓半横断损伤动物模型，A组植入组织工程化脊髓，B组植入神经干细胞+支架，c组植入支架材料，D组无移植物。术后3周和8周进行HE染色和免疫荧光组织化学检查观察种子细胞的存活和分化情况，并利用改良标准BBB评分和SEP检查评估动物的运动和感觉功能，了解组织工程化脊髓修复脊髓损伤的效果。 结果： 1．原代和传代细胞均表达NSC的特有标志物Nestin，NSC生长有3个明显的分期，即生长缓慢期、对数生长期和平台期。FSCE诱导分化3天和7天后，分别有16.37％和18.14％神经干细胞分化为神经元，明显高于对照组的6.77％和7.69％，二者之间具有显著的统计学差异(p<0.01)。 2．EDC交联的胶原生物相容性与胶原和DHT交联的胶原相比无明显差异，明显优于PGA和PLAG。EDC交联的胶原力学性能优于胶原和DHT交联的胶原，并显著降低了胶原的体外降解率。 3．体外构建的组织工程化脊髓含有NF200阳性细胞，GFAP阳性细胞及MBP阳性细胞。各种细胞成分均匀散布在三维网络支架结构中并不断分化发育成熟，新生的神经元及神经胶质细胞发出的轴突相互交错，形成较规则的网格结构。 4．术后第2周开始到第8周实验结束，A组和B组的功能评分明显高于C组和D组的动物，具有显著的统计学差别(P<0.01)。A组与B组相比，功能恢复更为明显(P<0.05)。术后第2周开始直至第6周，A组和B组动物的BBB评分恢复均比较迅速。6周以后进入平台期。术后6周，A组SEP的P<,1>,N<,1>波潜伏期较正常组显著延长(p<0.01)，但明显短于B组(p<0.05)，C组和D组(p<0.01)。术后3周和8周的组织学结果表明，A组移植物中大量标记细胞存活，细胞计数明显多于B组(P<0.01)。Brdu标记的细胞中，A组有较多NF200阳性细胞出现，GFAP阳性细胞在术后8周形成了规则的网格结构。而在B组，也有一定数量的NF200阳性细胞，GFAP细胞形成的网络结构缺乏规则，较A组杂乱。C组界面区也无胶质瘢痕过度增生，D组的脊髓缺损区被瘢痕组织填充。 结论： 1．胚胎脊髓提取液支持神经干细胞成活并有效的诱导其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 2．采用EDC交联制备的胶原海绵保持了胶原固有的良好的生物相容性，同时在细胞培养介质中塌陷不明显，仍保持其形状和多孔性，体外试验表明改性胶原降解速度显著减慢，有利于作为脊髓组织工程中的支架材料。 3．以改性胶原为支架材料，神经干细胞为种子细胞，并以胚胎脊髓提取液提供细胞因子和细胞外基质所构建的组织工程化脊髓，在体外可进一步成熟并分化，其内包含有神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等成分，有独特的组织结构。 4．以改性胶原为支架的组织工程化脊髓移植至成年鼠体内后，其种子细胞存活并进一步分化，形成功能相活跃的神经元，分化的胶质细胞形成了较为规则的的网状结构。改性胶原为支架的组织工程化脊髓对成年鼠损伤脊髓的结构重建和功能恢复都有一定的作用。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

摘要

前 言

第一部分神经干细胞的培养和体外诱导分化

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第一部分照片

参考文献

第二部分脊髓组织工程支架材料的构建和选择

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第二部分照片

参考文献

第三部分改性胶原支架组织工程化脊髓的体外构建

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分照片

参考文献

第四部分改性胶原支架组织工程脊髓修复成年鼠急性脊髓损伤

材料与方法

结 果

讨论

小 结

第四部分照片

参考文献

全文结论

致谢

综述一神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

综述二脊髓组织工程支架材料的研究进展

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