人脑星形细胞肿瘤VEGF分布与微血管构筑关系的定量病理学研究

摘要

星形细胞肿瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的胶质瘤类型，其血管生成活跃。血管内皮生长因子(vascularendothelial.growthfactor,VEGF)是血管生成中起主要作用并研究的最为深入的血管生成因子之一，它与其受体结合后促进血管内皮细胞增殖分化、血管重塑而致血管生成。肿瘤内VEGF表达以及微血管密度(microvesseldensity,MVD)的测定可作为判断脑星形细胞瘤恶性潜能的重要生物学指标和病理诊断、预后判断指标，检测VEGF的表达状态对进一步认识肿瘤血管形成的机制有重要作用。肿瘤问质中新生微血管的密度、形态、结构(组成)及其随肿瘤演进在瘤组织内的三维分布可统称为“肿瘤微血管构筑表型”(tumormicrovasculararchitecturephenotype，T-MAP)。研究发现在癌前病变与癌之间、原发瘤与转移瘤之间T-MAP存在差异；另一方面，抗癌药治疗的过程对微血管构筑也有明显影响，提示T-MAP在肿瘤学上有重要意义。T-MAP的多样性和差异性统称为T-MAP异质性(T-MAPheterogeneity，T-MAPH)。组织芯片(tissuechips)，或称组织微阵列(tissuemicroarray)，是将数十个甚至上千个不同病人的组织标本集成在一张固相载体上所形成的组织微阵列。组织芯片为医学分子生物学提供一种高量、大样本以及快速的分子水平分析工具。它克服了传统病理学制样方法中存在的操作复杂、自动化程度低、检测效率低等缺陷，可有效利用成百上千份自然或处于疾病状态下的组织标本来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相关关系。组织芯片技术以其高通量的特性使得科研人员能同时对大量标本的基因、基因转录及蛋白表达水平进行研究并能进行很好的质控，从而提高研究结果的可靠性。因此，利用免疫组织化学双染技术在组织芯片上定量分析微血管构筑参数以及VEGF表达情况，能对胶质瘤的诊断、疗效评估等提供客观的依据，为肿瘤的抗血管生成治疗的新思路、新策略提供理论基础。图像分析技术可以间接地反映肿瘤细胞生物学行为的改变，成为一项非常便捷的分析检测技术。 肿瘤血管生成中，T-MAPH还包括血管构成的三维形态，在普通光学显微镜下，很难观察到微血管构筑的三维形态，而在计算机辅助三维重建技术产生并实用化后，利用组织连续切片对肿瘤不同发展阶段肿瘤组织中的微血管内皮细胞的分布情况进行三维重建，并对T-MAPH的三维形态进行观察和测量，从而从空间构型上实现显示组织中微血管内皮细胞，在深入探讨细胞因子与血管生成以及临床预后、疗效评估等各方面中有着重要的意义。 本研究以在本科室前期完成的含有不同级别和不同微血管形态的星形细胞肿瘤组织组织芯片的基础上，应用免疫双标技术和图像分析方法对微血管数目、微血管平均周长和VEGF阳性单位(positiveunit,PU)值进行定量分析，且应用三维重建技术对总厚度为320μm的肿瘤组织连续切片中CD34阳性内皮细胞的空间分布进行重建，并对所获得的数据进行统计处理和应用数学软件进行分析。主要结果和结论如下： 一、对人脑星形细胞肿瘤组织芯片进行CD34/VEGF免疫组织化学双标和图像分析及统计分析发现VEGFPU值、微血管密度随肿瘤的级别升高而增大，而肿瘤中微血管的平均周长随之减小 在本科室前期完成的168点阵组织芯片(80例人脑星形细胞肿瘤，其中弥漫性星形细胞瘤31例，问变性星形细胞瘤32例，胶质母细胞瘤17例；所制芯片点阵排列为薄壁血管WHOII级43点、WHOⅢ级38点、WHOⅣ级23点；厚壁血管WHOⅢ级24点、WHOⅣ级16点；肾小球样血管wHOⅣ级11点；血管心假菊形团样结构血管WHOII级1点、WHOⅢ级2点、WHOⅣ2点)上进行CD34和VEGF双标记，并在此基础上利用图像分析软件ImageProPlus5.1中文版对微血管构筑参数和VEGF的表达进行定量分析，结果显示，胶质瘤组织中VEGFPU值和微血管密度随着肿瘤级别的增高而增大，各级别之间有显著性差异；血管平均周长随着肿瘤级别的增高而减小，问变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤无显著差异，两者分别与弥漫性星形细胞瘤之间有显著差异，这与既往定性分析结果吻合[1,18-22]。结果说明，微血管密度、血管平均周长能作为微血管构筑参数应用；在胶质瘤血管生成和级别判定中可客观的运用VEGFPU值。 二、星形细胞肿瘤中VEGF的表达量和分布存在不同的模式，它不仅促进了血管生成，而且与微血管分布之间存在数学模型关系。 采用免疫组织化学双重染色技术分别标记星形细胞瘤组织芯片中(CD34和VEGF，采集染色结果，选择不同级别的单个点阵，并随机选取其中圆度为1.000～1.350的微血管，利用图像分析软件对血管周围各点的VEGF进行光密度测定以及点坐标定位，通过计算和分析，建立VEGF浓度梯度与离壁距离的数学方程式。结果表明：VEGF在瘤组织内的分布与新生微血管的分布和形态有密切关系，选定范围内(离壁距离0～8μm)测定点的VEGF光密度值(浓度，y)与该点到血管壁的距离(x)的数学关系模型为：Y=1/√45.1+6.06x(相关系数R＝0.6124，P＜0.001)。在不同星形细胞肿瘤中VEGF的表达量和分布存在不同的模式，这表明VEGF不仅促进了血管生成，而且与微血管分布之间有数学模型关系 三、采用三维重建技术构建出肿瘤微血管内皮细胞的空间分布 应用计算机三维重建软件3DDOCTOR对人脑弥漫性星形细胞瘤连续切片中不同区域的CD34阳性细胞进行三维重建，成功构建了星形胶质细胞瘤部分微血管内皮的三维结构，结果显示星形细胞肿瘤内微血管分枝而不均一，甚至部分血管有扭曲走向，以大量新生的幼稚毛细血管为主，同时存在管腔较大的微血管、微血管出芽生成的单盲端血管以及单个内皮细胞聚集成索状的现象。恶性星形细胞肿瘤的微血管不仅丰富，而且具有形态结构的多样性和异质性，这一特点对于认识恶性肿瘤血管生成三维结构特性、构建数字化虚拟肿瘤微血管模型及其在抗血管生成治疗上可能有重要意义。 本研究的意义： 肿瘤微血管构筑表型异质性的存在，与肿瘤细胞分泌的生长因子尤其是VEGF构成的微环境对微血管内皮异质性存在着调控作用，因此研究微血管周围VEGF的分布与微血管之间的关系，对提示肿瘤微血管构筑异质性的发生机制具有重要理论意义。本研究获得的血管构筑参数、VEGF表达数据以及肿瘤组织中微血管内皮细胞分布特征，构建的数字化肿瘤微血管构筑、分析星形细胞肿瘤微血管与血管生成因子之间的数学模型关系的结果，为深入研究肿瘤微环境对微血管构筑异质性调控作用的机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词一览表

声明

前 言

第一部分 人脑星形细胞肿瘤VEGF PU值、微血管密度及平均周长与肿瘤级别的关系

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分人脑星形细胞肿瘤微血管周血管VEGF分布模式初探

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分星形细胞肿瘤微血管构筑三维重建的初步研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

图 片

参考文献

文献综述 病理学定量研究与模糊数学

攻读硕士学位期间撰写和发表的论文