莪术油有效成分提取、分离及其纳米胶束的制备与活性评价

摘要

莪术醇(Curcumol；Cc)和莪术二酮(Curdione；Cd)是莪术油的两个重要组分。Cc是莪术油中的主要有效成分之一。本实验室及国内其他实验室既往的研究工作发现，Cc能够抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡，对卵巢癌、宫颈癌、肝癌和结肠癌等也有效。Cd是莪术油含量最高的成分，目前对其研究较少。提取、分离Cc和Cd的单体，制备有效的剂型并初步评价其活性，对于充分、合理利用中药莪术资源具有重要意义。但Cc和Cd在水中的溶解度都很低，难以达到有效的治疗浓度。现代药物传递系统不仅可以增加药物的溶解度，同时也可以达到缓释和靶向的目的。共聚物纳米胶束是一种新型的药物传递系统，与其它载药系统相比有良好的生物相容性和安全性；药物负载能力较强，对于疏水药物，可以较大地改善其溶解性；粒径可以达到纳米级(10-100nm)，外壳具有柔韧性和亲水性，可大大降低胶束被网状内皮系统识别和摄取的机会；稳定性好，具有很高的耐稀释能力；制备工艺简单，易于产业化。 本课题拟选用两亲嵌段共聚物Pluronics为制备纳米胶束的辅料，分别制备莪术醇纳米胶束(CcNM)和莪术二酮纳米胶束(CdNM)，并对它们进行初步活性评价。 方法：用低温结晶-柱层析法提取Cc和Cd，并制备Cd的对照品。建立Cc体外测定方法；选择PluronicP123和PluronicF68为辅料，选择熔融法制备CcNM。在单因素考察的基础上做三因素，五水平的星点设计，对试验结果进行多元线性和二项式拟和，对最优拟和方程用效应面法进行预测分析以选取最佳处方。以MTT法测定CcNM对K562增殖的抑制作用，流式细胞仪检测CcNM对细胞周期的影响，用Annexin-v/PI双染色通过流式细胞仪检测细胞早期凋亡。建立Cd体外测定方法；选择PluronicP123为辅料，熔融法制备CdNM，在单因素考察的基础上，做二因素，五水平的星点设计，对结果进行多元线性和二项式拟和，对最优拟和方程用效应面法进行预测分析以选取最佳处方。血细胞计数仪检测化疗小鼠血象；称重法测定脾指数、胸腺指数；显微镜下计数骨髓有核细胞数；肝、脾、胸腺和股骨病理学检查等方法考察CdNM对化疗小鼠造血系统的改善作用。 结果： 1.分离得到了Cd和Cc；Cd的纯度达到98％以上，可以做为对照品使用。 2.建立测定CcNM中Cc含量的方法，专属性强，重复性好，方法简便灵敏。星点设计-效应面法进行CcNM处方优化，获得最佳处方为Cc:20mg，水相量：50ml，PluronicF68用量：500mg，优化处方验证结果表明实验值与预测值的偏差较小，模型预测性良好。CcNM在体外30h释放了84％，说明CcNM具有缓释作用。 3.CcNM(Cc浓度为10-100μg/ml)能抑制K562细胞增殖；CcNM(Cc浓度为100μg/ml)处理24h和48h使K562细胞出现Sub-G1峰，比例分别为14.93％和23.19％；CcNM(Cc浓度为100μg/ml)使K562细胞的早期凋亡细胞(AnnexinV十/PI-细胞)明显增加，处理24h和48h分别达到57.86％和88.46％。 4.建立测定CdNM胶束中Cd含量的方法，专属性强，重复性好，方法简便灵敏。星点设计-效应面法进行CdNM处方优化，获得最佳处方为Cd:20mg，水相量：50ml，优化处方验证结果表明实验值与预测值的偏差较小，模型预测性良好。CdNM在体外30h释放了77.1％，说明CdNM具有缓释作用。 5.CdNM能够显著升高化疗小鼠WBC、RBC和PLT的水平，并能显著升高脾指数和骨髓有核细胞数，对胸腺指数影响不大，病理学结果表明CdNM能改善化疗小鼠骨髓、脾脏受抑制状况。 结论： 1.建立了实验室提取Cc和Cd的方法，并制备了Cd对照品。 2.制备了新型纳米制剂CcNM和CdNM，它们不仅能分别增加Ce和Cd的溶解度，在体外还具有缓释的特性。 3.CcNM能够抑制白血病细胞株K562增殖并导致其凋亡。 4.CdNM对化疗小鼠受抑制的造血系统有改善作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前言

第一部分莪术油中有效成分的提取、分离

材料与方法

结果

结论

第二部分CcNM的制备及其对白血病细胞K562的作用

材料与方法

结果

讨论

第三部分CdNM的制备及其对化疗小鼠造血系统的改善作用

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一两亲共聚物胶束在药物DDS中的应用进展

文献综述二莪术油的研究进展

攻读博士学位期间已发表论文